大鼠Fas shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其抑制腎小管上皮細(xì)胞Fas基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的: 構(gòu)建四個(gè)Fas shRNA真核表達(dá)重組質(zhì)粒，并檢測其對(duì)NRK-52E細(xì)胞(大鼠腎小管上皮細(xì)胞)Fas基因的沉默效率，篩選出一個(gè)最有效干擾質(zhì)粒。然后使用細(xì)胞因子刺激NRK-52E細(xì)胞，體外模擬腎小管上皮細(xì)胞在腎移植急性排斥反應(yīng)階段所處的環(huán)境。驗(yàn)證該干擾質(zhì)粒在腎小管上皮細(xì)胞高表達(dá)Fas基因的情況下對(duì)該基因的抑制效果。為進(jìn)一步研究RNA干擾技術(shù)在同種異體腎移植中誘導(dǎo)免疫耐受，保護(hù)供腎的作用奠定基礎(chǔ)。 方法: 1.Fas

2、 shRNA干擾靶點(diǎn)的選擇及轉(zhuǎn)錄模板DNA鏈的設(shè)計(jì)、合成：按照siRNA設(shè)計(jì)原則，在大鼠Fas基因mRNA上挑選四個(gè)干擾靶序列，EGFP的干擾序列采用Carl D.Novina等所提供的已經(jīng)驗(yàn)證有效的序列；再根據(jù)靶序列分別設(shè)計(jì)并合成兩端含有酶切位點(diǎn)的總長度為64bp的shRNA轉(zhuǎn)錄模板DNA正、反義寡核苷酸鏈。 2.pSilencer Fas/EGFP shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建：將正、反義寡核苷酸鏈煺火后克隆至經(jīng)酶切回收后的空載

3、體pSilencerTM3.1-H1 neo siRNA Expression Vector中。經(jīng)過PCR、酶切及測序鑒定后對(duì)重組質(zhì)粒分別命名為：pSilencerIFas1 shRNA、pSilencer-Fas2 shRNA、pSilencer-Fas3 shRNA、pSilencer-Fas4 shRNA及pSilencer-EGFP shRNA。 3.用LipofectamineTM LTX Reagent將pSilen

4、cer Fas(1.2.3.4)四個(gè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)內(nèi)，并以pSilencer-EGFP shRNA和pEGFP-N1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染來做陽性對(duì)照，陰性對(duì)照采用Ambion公司提供的陰性對(duì)照質(zhì)粒。經(jīng)過G418壓力性篩選后，使用RT-PCR和蛋白免疫印跡法分析針對(duì)Fas基因構(gòu)建的四個(gè)重組質(zhì)粒的有效性，篩選出最有效的干擾質(zhì)粒。 4.使用重組大鼠干擾素-γ(rr IFN-γ)和重組大鼠腫瘤壞死因子-α(rr

5、TNF-α)刺激NRK-52E細(xì)胞，體外模擬腎移植后急性排斥反應(yīng)階段腎小管上皮細(xì)胞Fas表達(dá)情況。分為正常細(xì)胞組，單加rr IFN-γ組(終濃度500U/ml)，單加rr TNF-α組(終濃度20ng/ml)，rr IFN-γ和rr TNF-α共刺激組(終濃度分別500U/ml和20ng/ml)四組，進(jìn)行RT-PCR和蛋白免疫印跡法分析，檢測各組對(duì)Fas表達(dá)最的影響效果。 5.使用篩選出的Fas shRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染經(jīng)細(xì)胞因子

6、刺激過的NRK-52E細(xì)胞，進(jìn)行RT-PCR和蛋白免疫印跡法分析，確定其在炎癥因子影響下對(duì)Fas基因的干擾效果。 結(jié)果: 1.PCR、雙酶切及測序證實(shí)pSilencer-Fas1 shRNA、pSilencer-Fas2 shRNA、pSilencer-Fas3 shRNA、pSilencer-Fas4 shRNA及pSilencer-EGFP shRNA五個(gè)鶯組子均構(gòu)建成功。 2.在陽性對(duì)照組中，經(jīng)pSilen

7、cer-EGFP shRNA和pEGFP-N1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的NRK-52E細(xì)胞熒光表達(dá)的數(shù)量及亮度均明顯低于pEGFP-N1單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，證明了該載體介導(dǎo)RNA干擾的有效性。其余轉(zhuǎn)染組除pSilencer-Fas1 shRNA轉(zhuǎn)染組及陰性對(duì)照組外，F(xiàn)as基因的mRNA及蛋白表達(dá)水平均低于正常細(xì)胞組，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，最終確定pSilencer-Fas4 shRNA對(duì)Fas基因的抑制率最高，分別達(dá)到78.9％和64.5％。 3.使用重組

8、大鼠干擾素-γ(rr IFN-γ)和重組大鼠腫瘤壞死因子-α(rr TNF-α)刺激NRK-52E細(xì)胞。24-48h后，F(xiàn)as基因的mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于正常細(xì)胞組，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，認(rèn)為rr IFN-γ和rr TNF-α共刺激可使NRK-52E細(xì)胞Fas基因的表達(dá)量提高最顯著。在mRNA及蛋白水平分別達(dá)到正常細(xì)胞的2.37倍和2.53倍。 4.在細(xì)胞因子刺激的環(huán)境下,psilencer-Fas4 ShRNA 仍能夠使NRK

9、-52E細(xì)胞Fas基因的mRNA及蛋白表達(dá)量下降到正常細(xì)胞組的36.4％和44.2％。說明其在炎癥因子刺激的環(huán)境下，依然能夠有效抑制Fas基因的表達(dá)。 結(jié)論: 利用RNA干擾技術(shù)沉默大鼠Fas基因，可以降低大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)Fas的表達(dá)；同時(shí)在體外模擬腎移植后急性排斥反應(yīng)階段，炎癥因子刺激的環(huán)境下依然能夠有效抑制Fas的表達(dá)。為進(jìn)一步研究RNA干擾技術(shù)在同種異體器官移植中誘導(dǎo)特異性免疫耐受和保護(hù)移植物奠定了基礎(chǔ)