心臟重構(gòu)過程心室應(yīng)變與生存蛋白的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景和目的：心肌梗塞是臨床上常見的疾病，心肌梗塞后心臟重構(gòu)與致殘和致死密切相關(guān)。心肌梗塞后發(fā)生一系列分子生物學(xué)改變參與心臟重構(gòu)過程。許多生長因子和細(xì)胞因子均可誘導(dǎo)絲氨酸/蘇氨酸激酶Pim-1，Pim-1進(jìn)而在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。最近研究發(fā)現(xiàn)Pim-1在心肌細(xì)胞中是Akt下游重要的生存調(diào)節(jié)子。許多研究關(guān)注于Akt在心肌細(xì)胞中的保護(hù)作用，但Pim-1作為信號蛋白的心臟保護(hù)作用還有待闡明。為了探討心肌梗塞后心臟重構(gòu)的細(xì)胞分子生物學(xué)

2、改變及其相關(guān)機(jī)制并重點(diǎn)對Pim-1在其中的作用進(jìn)行探討，本實(shí)驗(yàn)通過綿羊心肌梗塞后心臟重構(gòu)的動物模型，克隆并測序綿羊Pim-1信使RNA，探討Pim-1相關(guān)生存蛋白在重構(gòu)心肌中與重構(gòu)張力和心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系。 方法：2007年受國家留學(xué)基金公派到美國馬里蘭大學(xué)，實(shí)行聯(lián)合培養(yǎng)計(jì)劃，對冠狀動脈缺血性心臟病進(jìn)行相關(guān)課題的研究，選擇心肌梗塞后心臟重構(gòu)的相關(guān)研究。采用Dorset雄性雜交綿羊13只，隨機(jī)分為兩組：未手術(shù)組（n=5）和手術(shù)組（

3、n=8）。手術(shù)組采用直接縫扎冠狀動脈造成心尖部25％心肌梗塞。采集血流動力學(xué)和超聲心動圖，使用超聲微測量技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測左室游離壁的運(yùn)動和形變，計(jì)算收縮末期和舒張末期張力，并收集未手術(shù)組和手術(shù)組心肌梗塞后10周的左室游離壁心肌組織行HE染色，評價(jià)動物模型和心臟重構(gòu)的區(qū)域性。采取手術(shù)組左室游離壁心肌組織，提取總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成cDNA，使用特異性引物擴(kuò)增PIM-1信使RNA，以Sanger末端終止法測序，使用軟件進(jìn)行拼接和分

4、析。采取未手術(shù)組和手術(shù)組心肌梗塞后10周的左室游離壁遠(yuǎn)離梗塞區(qū)和臨近梗塞區(qū)心肌組織行實(shí)時(shí)定量PCR、WesternBlot檢測Pim-1相關(guān)生存蛋白在重構(gòu)心肌中的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，免疫共沉淀檢測不同區(qū)域Pim-1與其降解途徑中重要分子伴侶Hsp70、Hsp90的關(guān)系，免疫熒光染色顯示Pim-1的分布，TUNEL檢測細(xì)胞凋亡。 結(jié)果：心肌梗塞后手術(shù)組實(shí)驗(yàn)動物左室收縮末期容積和左室舒張末期容積顯著增加，射血分?jǐn)?shù)顯著降低，室壁運(yùn)動異常長

5、度及室壁運(yùn)動異常長度與同切面心內(nèi)膜周長的比值均顯著增加，心率、血壓、心輸出量無顯著性差異。收縮末期和舒張末期張力呈區(qū)域性分布，在心肌梗塞區(qū)、臨近梗塞區(qū)與遠(yuǎn)離梗塞區(qū)之間有顯著差異，收縮末期張力顯著下降，舒張末期張力顯著增加。克隆并測序綿羊PIM-1信使RNA1341bp，分析發(fā)現(xiàn)其使用兩個(gè)不同的起始密碼子編碼分子量為33kD和44kD的Pim-1蛋白，與人類及其他哺乳動物有高度同源性，5’端非編碼區(qū)對于PIM-1信使RNA翻譯起重要作用。

6、與未手術(shù)組相比，手術(shù)組臨近梗塞區(qū)PIM-1mRNA、全細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)44kD、33kDPim-1蛋白顯著增加，遠(yuǎn)離梗塞區(qū)無明顯增加；Pim-1上游調(diào)控蛋白Akt在手術(shù)組臨近梗塞區(qū)顯著增加，在遠(yuǎn)離梗塞區(qū)無明顯增加；臨近梗塞區(qū)與Pim-1結(jié)合的Hsp90和Hsp70的比值顯著增加，遠(yuǎn)離梗塞區(qū)無明顯變化；Pim-1下游關(guān)鍵的抗凋亡蛋白：Bcl-2mRNA和蛋白在手術(shù)組臨近梗區(qū)明顯增加，Bcl-xLmRNA無明顯變化，Bcl-xL蛋白臨近梗塞區(qū)增

7、加，磷酸化Bad（Ser112）蛋白在臨近梗塞區(qū)明顯增加，遠(yuǎn)離梗塞區(qū)均無明顯變化；TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)在臨近梗塞區(qū)顯著增加，遠(yuǎn)離梗塞區(qū)無明顯增加。重構(gòu)張力和對應(yīng)的生存蛋白水平相關(guān)分析顯示生存蛋白水平與重構(gòu)張力呈顯著正相關(guān)。 結(jié)論：冠狀動脈結(jié)扎術(shù)建立綿羊心肌梗塞后心臟重構(gòu)動物模型，可作為單發(fā)中等大小的心肌梗塞后心臟重構(gòu)代表性的動物模型。通過心室表面超聲微探頭陣列實(shí)時(shí)監(jiān)測心臟重構(gòu)發(fā)現(xiàn)心肌梗塞后心臟重構(gòu)是不均一的，收縮末期張力和舒張末

8、期（重構(gòu)）張力存在區(qū)域性的差別。綿羊PIM-1信使RNA全編碼區(qū)和部分非編碼區(qū)以及翻譯產(chǎn)物與人及其他哺乳動物有高度同源性，在進(jìn)化上高度保守。它可使用兩個(gè)不同的起始密碼子編碼分子量為33kD和44kD的Pim-1蛋白，5’端非編碼區(qū)對于其翻譯起重要作用。綿羊心臟重構(gòu)模型中Pim-1水平受多種調(diào)節(jié)機(jī)制控制，Pim-1相關(guān)生存蛋白呈區(qū)域性分布，并與重構(gòu)張力相關(guān)，但這種上調(diào)不足以保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡。 創(chuàng)新和展望 1.首次成功建