真菌產(chǎn)生的低分子抗菌肽的發(fā)酵生產(chǎn)、分離純化及其性質(zhì)研究.pdf

1、抗生素在臨床治療中的廣泛使用挽救了不計(jì)其數(shù)的生命，同時(shí)，抗生素的濫用也促使抗藥菌群迅猛發(fā)展，某些感染性疾病成為臨床治療的難題，能夠?qū)鼓退幘男滦涂股氐难邪l(fā)迫在眉睫。本文對由山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選出來的一株產(chǎn)生低分子抗菌肽的青霉菌Penicillium sp.M03進(jìn)行研究，在其發(fā)酵液中提取到一種具有抗菌活性的的肽類物質(zhì)AF2，并對其基本性質(zhì)進(jìn)行了研究。 本文首先進(jìn)行了預(yù)試驗(yàn)，證明了Penicillium sp.

2、M03可以代謝產(chǎn)生抗菌肽，并且這種物質(zhì)可以分泌到培養(yǎng)基中。為提高菌種發(fā)酵產(chǎn)生抗菌肽的能力，論文對真菌 Penicillium sp.M03產(chǎn)生抗菌肽的發(fā)酵條件進(jìn)行了初步的優(yōu)化，篩選了實(shí)驗(yàn)室條件下適宜的碳源、氮源、碳氮源之比、pH、溫度、接種量和發(fā)酵時(shí)間。Penicillium sp.M03能夠利用多種碳源和氮源合成抗菌肽，綜合考慮多種因素，最后確定抗菌肽的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：淀粉30g，K<,2>HPO<,4> 1g，KCl0.05g，(

3、NH<,4>)<,2>SO<,4> 18g，MgSO<,4>·7H<,2>O0.5g，F(xiàn)eSO<,4> 0.01g，蒸餾水1L。種子培養(yǎng)基為：葡萄糖30g，K<,2>HPO<,4> 1g，KCI 0.05g，(NH<,4>)<,2>SO<,4> 18g，MgSO<,4>.7H<,2>O 0.5g，F(xiàn)eSO<,4> 0.01g，蒸餾水1L。最佳發(fā)酵條件為：pH 6.5，溫度30℃，接種量為10﹪，搖床培養(yǎng)5天。 在對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)

4、化后，論文對青霉菌Penicillium sp.M03進(jìn)行了小型發(fā)酵罐的放大試驗(yàn)，與搖瓶發(fā)酵相比，使用發(fā)酵罐對真菌進(jìn)行發(fā)酵可以使發(fā)酵液中的抗菌肽濃度提高大約五倍，縮短發(fā)酵時(shí)間(發(fā)酵罐上的最佳發(fā)酵時(shí)間為三天)，提高一次發(fā)酵所得到的抗菌肽的量。由于真菌生長比較緩慢，因此在發(fā)酵早期容易出現(xiàn)感染雜菌的現(xiàn)象，論文在第三章的最后對發(fā)酵中出現(xiàn)染菌現(xiàn)象后的分析和解決方法進(jìn)行了總結(jié)。 發(fā)酵液經(jīng)過紗布過濾、離心、超濾、冷凍干燥等一系列處理得到黃色粉

5、末，再經(jīng)S印hadex LH-20，Sepharose-DEAE FF柱層析進(jìn)行分離純化，最后經(jīng)過S印hadexG-15脫鹽得到純凈物質(zhì)，在此過程中活性峰采用平板抑菌法來確定。通過對AF2的紅外光譜、核磁共振<'1>H和<,13>C光譜和質(zhì)譜的解析，初步判斷AF2是一種低分子多肽，分子量約為1155。AF2氨基酸組成分析結(jié)果顯示其含有天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等氨基酸殘基。AF2的