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1、恩諾沙星(Enrofloxacin,EF)是一種動(dòng)物專用的氟喹諾酮類(Fluoroquinolone,F(xiàn)Qs)藥物,為人工合成的新型廣譜殺菌性抗菌藥物,廣泛用于水產(chǎn)及畜禽養(yǎng)殖,已經(jīng)成為我國(guó)目前常用的漁藥和獸藥之一。近年來(lái)關(guān)于FQs藥物臨床應(yīng)用時(shí)所產(chǎn)生的耐藥性、殘留毒性以及不良反應(yīng)的報(bào)道越來(lái)越多,食品中相應(yīng)殘留的檢測(cè)也愈加引起人們的重視。 目前,對(duì)FQs藥物殘留的檢測(cè)方法主要是色譜法,但更為簡(jiǎn)便、快速的篩選檢測(cè)方法則較為缺乏。從近
2、年來(lái)食品中化學(xué)污染物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)來(lái)看,免疫分析法是最有前途的藥殘快速檢測(cè)方法之一。 本研究旨在研究EF完全抗原的合成與鑒定方法,并在所制備多克隆抗體(Polyclonalantibodies,PcAbs)的基礎(chǔ)上,初步建立一種間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法(Indirectcompetitiveenzyme-1inkedimmunosorbentassays,Ci-ELISA),以檢測(cè)動(dòng)物可食組織中EF殘留。實(shí)驗(yàn)分為三部分:第一部
3、分為EF完全抗原合成及鑒定。包括載體蛋白的封閉;比較碳二亞胺法和活化酯法二種合成方法對(duì)完全抗原合成地影響;利用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)合成過(guò)程的主要因素進(jìn)行優(yōu)化;采用紫外圖譜、偶聯(lián)比、抗體效價(jià)以及基質(zhì)輔助激光解吸與離子化時(shí)間飛行質(zhì)譜對(duì)偶聯(lián)情況進(jìn)行鑒定。第二部分為抗體的制備與鑒定。完全抗原免疫BALB/C小鼠獲得抗體,測(cè)定抗體的效價(jià)并檢測(cè)其特異性。第三部分初步建立Ci-ELISA方法檢測(cè)樣品中EF殘留情況,并對(duì)方法的準(zhǔn)確度和靈敏度等指標(biāo)進(jìn)行了評(píng)價(jià),檢測(cè)
4、結(jié)果均經(jīng)HPLC方法確證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下: 1.實(shí)驗(yàn)首次采用乙二胺(Ethyldiamine,EDA)對(duì)載體蛋白進(jìn)行封閉處理,從紫外圖譜以及抗體效價(jià)結(jié)果可以看出,封閉可以明顯提高完全抗原的合成效果。 2.正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在載體蛋白、偶聯(lián)時(shí)間和EF與載體蛋白的摩爾比三因素中,載體蛋白具有較為明顯的影響,其中雞血清白蛋白(Ovalbumin,OVA)的效果最好;較好的EF與載體蛋白的摩爾比為75:1,較好的偶聯(lián)時(shí)間為24h。
5、 3.不同的合成方法對(duì)不同載體蛋白合成完全抗原的性能具有一定影響。從偶聯(lián)比和效價(jià)的結(jié)果來(lái)看,OVA采用活化酯法效果較好,而牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin,BSA)采用碳二亞胺法得到的血清效價(jià)較高。 4.酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbentassays,ELISA)測(cè)定抗體的效價(jià),以BSA為載體的完全抗原產(chǎn)生的抗體效價(jià)可達(dá)1:250000,以O(shè)VA為載體的完全抗原效價(jià)高達(dá)
6、1:300000。選擇四種EF結(jié)構(gòu)類似物,四種其他族抗生素做抗體的競(jìng)爭(zhēng)抑制率,結(jié)果表明:不論以何種蛋白為載體的完全抗原產(chǎn)生的抗體對(duì)四種其它族抗生素的抑制率均<0.01%,而對(duì)四種結(jié)構(gòu)類似物的抑制率分別為14.2%~161.7%,1.3%~169.8%。 5.Ci-ELISA方法的最低檢測(cè)限(Limitofdetection,LOD)為1ng/mL,線性范圍為1ng/mL~1000ng/mL??组g變異系數(shù)為9.8%~17.4%,批
7、間變異系數(shù)為11.9%~23.4%,添加回收率在60.07%~120.8%。 6.實(shí)際樣品中EF殘留檢測(cè)表明,Ci-ELISA方法和HPLC方法的檢測(cè)結(jié)果具有良好的相關(guān)性。 目前,針對(duì)食品中FQs類獸藥殘留,免疫檢測(cè)方法及技術(shù)較少有研究涉及;而關(guān)于該類小分子藥物,完全抗原合成條件、鑒定方法及其對(duì)偶聯(lián)效果和抗體性能的影響,以及完全抗原合成過(guò)程的主要工藝因素的優(yōu)化研究,尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)的研究成果能夠?yàn)镋F的免疫檢測(cè)提供基礎(chǔ)
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