恩諾沙星抗體制備及免疫檢測(cè)方法的初步研究.pdf

1、恩諾沙星(Enrofloxacin，EF)是一種動(dòng)物專用的氟喹諾酮類(Fluoroquinolone，F(xiàn)Qs)藥物，為人工合成的新型廣譜殺菌性抗菌藥物，廣泛用于水產(chǎn)及畜禽養(yǎng)殖，已經(jīng)成為我國(guó)目前常用的漁藥和獸藥之一。近年來(lái)關(guān)于FQs藥物臨床應(yīng)用時(shí)所產(chǎn)生的耐藥性、殘留毒性以及不良反應(yīng)的報(bào)道越來(lái)越多，食品中相應(yīng)殘留的檢測(cè)也愈加引起人們的重視。 目前，對(duì)FQs藥物殘留的檢測(cè)方法主要是色譜法，但更為簡(jiǎn)便、快速的篩選檢測(cè)方法則較為缺乏。從近

2、年來(lái)食品中化學(xué)污染物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)來(lái)看，免疫分析法是最有前途的藥殘快速檢測(cè)方法之一。 本研究旨在研究EF完全抗原的合成與鑒定方法，并在所制備多克隆抗體(Polyclonalantibodies，PcAbs)的基礎(chǔ)上，初步建立一種間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法(Indirectcompetitiveenzyme-1inkedimmunosorbentassays，Ci-ELISA)，以檢測(cè)動(dòng)物可食組織中EF殘留。實(shí)驗(yàn)分為三部分：第一部

3、分為EF完全抗原合成及鑒定。包括載體蛋白的封閉；比較碳二亞胺法和活化酯法二種合成方法對(duì)完全抗原合成地影響；利用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)合成過(guò)程的主要因素進(jìn)行優(yōu)化；采用紫外圖譜、偶聯(lián)比、抗體效價(jià)以及基質(zhì)輔助激光解吸與離子化時(shí)間飛行質(zhì)譜對(duì)偶聯(lián)情況進(jìn)行鑒定。第二部分為抗體的制備與鑒定。完全抗原免疫BALB/C小鼠獲得抗體，測(cè)定抗體的效價(jià)并檢測(cè)其特異性。第三部分初步建立Ci-ELISA方法檢測(cè)樣品中EF殘留情況，并對(duì)方法的準(zhǔn)確度和靈敏度等指標(biāo)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，檢測(cè)

4、結(jié)果均經(jīng)HPLC方法確證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.實(shí)驗(yàn)首次采用乙二胺(Ethyldiamine，EDA)對(duì)載體蛋白進(jìn)行封閉處理，從紫外圖譜以及抗體效價(jià)結(jié)果可以看出，封閉可以明顯提高完全抗原的合成效果。 2.正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在載體蛋白、偶聯(lián)時(shí)間和EF與載體蛋白的摩爾比三因素中，載體蛋白具有較為明顯的影響，其中雞血清白蛋白(Ovalbumin，OVA)的效果最好；較好的EF與載體蛋白的摩爾比為75：1，較好的偶聯(lián)時(shí)間為24h。

5、 3.不同的合成方法對(duì)不同載體蛋白合成完全抗原的性能具有一定影響。從偶聯(lián)比和效價(jià)的結(jié)果來(lái)看，OVA采用活化酯法效果較好，而牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin，BSA)采用碳二亞胺法得到的血清效價(jià)較高。 4.酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbentassays，ELISA)測(cè)定抗體的效價(jià)，以BSA為載體的完全抗原產(chǎn)生的抗體效價(jià)可達(dá)1：250000，以O(shè)VA為載體的完全抗原效價(jià)高達(dá)

6、1：300000。選擇四種EF結(jié)構(gòu)類似物，四種其他族抗生素做抗體的競(jìng)爭(zhēng)抑制率，結(jié)果表明：不論以何種蛋白為載體的完全抗原產(chǎn)生的抗體對(duì)四種其它族抗生素的抑制率均＜0.01％，而對(duì)四種結(jié)構(gòu)類似物的抑制率分別為14.2％～161.7％，1.3％～169.8％。 5.Ci-ELISA方法的最低檢測(cè)限(Limitofdetection，LOD)為1ng/mL，線性范圍為1ng/mL～1000ng/mL?？组g變異系數(shù)為9.8％～17.4％，批

7、間變異系數(shù)為11.9％～23.4％，添加回收率在60.07％～120.8％。 6.實(shí)際樣品中EF殘留檢測(cè)表明，Ci-ELISA方法和HPLC方法的檢測(cè)結(jié)果具有良好的相關(guān)性。 目前，針對(duì)食品中FQs類獸藥殘留，免疫檢測(cè)方法及技術(shù)較少有研究涉及；而關(guān)于該類小分子藥物，完全抗原合成條件、鑒定方法及其對(duì)偶聯(lián)效果和抗體性能的影響，以及完全抗原合成過(guò)程的主要工藝因素的優(yōu)化研究，尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)的研究成果能夠?yàn)镋F的免疫檢測(cè)提供基礎(chǔ)