量子點(diǎn)免疫熒光雙色標(biāo)記檢測醛糖還原酶和Toll樣受體4在細(xì)胞模型及糖尿病大鼠腎臟組織中的表達(dá).pdf

1、研究背景:
　　糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是嚴(yán)重危害人類健康的主要慢性疾病之一，糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)約占糖尿病人群的1/3，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能涉及到多種因素，包括醛糖還原酶(Aldose reductase，AR)和Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)。AR是糖代謝多元醇通路中的關(guān)鍵限速酶。AR過度表達(dá)不僅在糖尿病并發(fā)癥中發(fā)揮著重要作用

2、，還可能參與體內(nèi)多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，尤其是炎癥反應(yīng)。多項(xiàng)研究表明DN不只是代謝相關(guān)性疾病，亦是免疫及炎癥相關(guān)性疾病，炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致DN發(fā)生腎小管損傷。TLR4通過識(shí)別和結(jié)合病原相關(guān)分子參與細(xì)胞跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)，被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵跨膜蛋白。特異性蛋白標(biāo)志物的有效檢測對(duì)于疾病的診斷和治療有重要價(jià)值。常用的病理學(xué)檢測手段包括免疫組織化學(xué)法(Immunohistochemistry，IHC)和免疫

3、熒光染色法。但這兩種方法不易實(shí)現(xiàn)同一組織切片多種蛋白的同時(shí)檢測。量子點(diǎn)(Quantum dots，QDs)是一種新型的納米熒光材料，具著優(yōu)良的光學(xué)特性，是生物標(biāo)志物檢測，尤其是多種標(biāo)志物同時(shí)檢測的理想熒光探針。
　　目的:
　　研究AR和TLR4在細(xì)胞模型及糖尿病大鼠模型中的表達(dá)和意義，為糖尿病腎病的診斷和治療提供新思路。并利用量子點(diǎn)免疫熒光雙色標(biāo)記同時(shí)檢測AR和TLR4在腎組織中的表達(dá)，為探討二者的關(guān)系及量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)在疾

4、病診斷及治療中的價(jià)值奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、轉(zhuǎn)染含人醛糖還原酶基因的質(zhì)粒，構(gòu)建AR高表達(dá)的細(xì)胞模型;
　　2、制備及檢測QD-anti-AR、QD-anti-TLR4復(fù)合物熒光探針;
　　3、免疫細(xì)胞化學(xué)法和量子點(diǎn)免疫熒光標(biāo)記法檢測及定位COS-7細(xì)胞模型中AR的表達(dá);
　　4、糖尿病大鼠腎組織的病理學(xué)HE染色;
　　5、傳統(tǒng)IHC和量子點(diǎn)免疫熒光標(biāo)記法檢測AR和TLR4在糖尿病大鼠腎組織中的

5、表達(dá);
　　6、量子點(diǎn)免疫熒光雙色標(biāo)記法同時(shí)檢測糖尿病大鼠腎組織中AR和TLR4的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、免疫細(xì)胞化學(xué)法和熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況均證實(shí)AR高表達(dá)的COS-7細(xì)胞模型構(gòu)建成功，并利用量子點(diǎn)免疫熒光標(biāo)記法準(zhǔn)確定位了AR在細(xì)胞中的表達(dá)部位，位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜;
　　2、大鼠腎組織HE染色顯示:糖尿病大鼠腎小球體積明顯增大，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，提示該組大鼠出現(xiàn)糖尿病腎病早期病變;
　

6、　3、利用傳統(tǒng)IHC和量子點(diǎn)免疫熒光標(biāo)記法檢測到在糖尿病大鼠腎組織中AR表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)部位為腎小球毛細(xì)血管和腎間質(zhì)血管;
　　4、利用傳統(tǒng)IHC和量子點(diǎn)免疫熒光標(biāo)記法檢測到在糖尿病大鼠腎小管TLR4表達(dá)上調(diào)，其中在發(fā)生空泡變性的腎小管表達(dá)更明顯;
　　5、運(yùn)用量子點(diǎn)免疫熒光雙色標(biāo)記首次同時(shí)檢測到AR和TLR4在糖尿病大鼠腎組織的高表達(dá)，兩種蛋白的表達(dá)部位與單獨(dú)檢測的結(jié)果一致;
　　6、通過蛋白偶聯(lián)劑EDC分別將羧基修

7、飾QDs與AR抗體和TLR4抗體成功偶聯(lián)，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測偶聯(lián)產(chǎn)物，得到QDs與抗體的最佳偶聯(lián)比;
　　7、在對(duì)細(xì)胞和組織AR和TLR4蛋白的檢測中，優(yōu)化的QDs免疫熒光標(biāo)記技術(shù)包括QDs與抗體的復(fù)合物探針及親和素化的量子點(diǎn)，均顯示出良好的特異性和敏感性，其實(shí)驗(yàn)步驟方便快捷，非特異性著色較傳統(tǒng)IHC少。
　　結(jié)論:
　　1、成功構(gòu)建了AR高表達(dá)的COS-7細(xì)胞模型，并準(zhǔn)確定位了AR的表達(dá)部位，為靶向性篩選ARI

8、s奠定了基礎(chǔ);
　　2、通過IHC直觀的觀察到AR在糖尿病大鼠腎組織的分布情況，表明AR參與DN的發(fā)病進(jìn)程，且有可能作為DN發(fā)生發(fā)展的監(jiān)測指標(biāo);
　　3、TLR4在糖尿病大鼠發(fā)生空泡變性的腎小管中高表達(dá)，表明TLR4通過炎癥反應(yīng)介導(dǎo)DN的發(fā)生發(fā)展;
　　4、首次運(yùn)用量子點(diǎn)免疫熒光雙色標(biāo)記同時(shí)檢測到AR和TLR4在糖尿病大鼠腎組織的高表達(dá)，提示AR和TLR4蛋白共同參與了DN的發(fā)病過程，兩者可能在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)方面存在一定