腎上腺髓質(zhì)素基因轉(zhuǎn)染增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)心肌梗死大鼠心室重構(gòu)及心功能的治療作用.pdf

1、第一部分?jǐn)y帶腎上腺髓質(zhì)素基因的腺病毒體外轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞及其ADM的表達(dá) 目的：將帶有Lac-Z基因和ADM基因的腺病毒載體，感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察其感染率及ADM的表達(dá)。 方法：將構(gòu)建好的Ad-ADM、Ad-LacZ進(jìn)行體外擴(kuò)增、噬斑法測(cè)定病毒滴度;貼壁法體外分離、擴(kuò)增培養(yǎng)并鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；用x-gal染色檢測(cè)腺病毒對(duì)MSCs感染率，ELISA和RT-PCR檢測(cè)ADM在MSCs中的表達(dá)。

2、 結(jié)果：大鼠MSCs傳代后細(xì)胞逐漸呈均一的長(zhǎng)梭樣，放射狀或柵欄樣生長(zhǎng)；病毒擴(kuò)增后噬斑試驗(yàn)測(cè)定的滴度為Ad-LacZ的病毒滴度為2.6×109pfu/ml，Ad-ADM的病毒滴度為1.1×109 pfu/ml。腺病毒(Ad-LacZ)對(duì)MSCs的轉(zhuǎn)染率與病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)具有量效關(guān)系，MOI為150時(shí)細(xì)胞的感染率達(dá)95.4％；轉(zhuǎn)染Ad-ADM后，MSCs可有效表達(dá)ADM，7d時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰，與對(duì)照組相比明顯增加(pg/ml:26.5

3、3±1.42 VS1.34±0.075，P<0.05)，15d后與對(duì)照組無差別(pg/ml:2.2±1.44 VS1.52±0.33，P>0.05)；RT-PCR支持這一結(jié)果。結(jié)論：①腺病毒對(duì)MSCs有較高的轉(zhuǎn)染效率。②感染Ad-ADM后，MSCs可有效表達(dá)ADM。 第二部分轉(zhuǎn)染腎上腺髓質(zhì)素基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠心肌梗塞的治療作用。 目的：研究轉(zhuǎn)染腎上腺髓質(zhì)素基因(Ad-ADM)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)移

4、植對(duì)大鼠心肌梗塞治療的作用。 方法：通過結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支制備大鼠心肌梗塞模型；以DAPI標(biāo)記細(xì)胞通過心肌局部注射移植MSCs并隨機(jī)分組如下：注射無胎牛血清的L-DMEM(100μ1)為A組，作為對(duì)照組；注射單純Ad-ADM腺病毒(100μ1)為B組；注射MSCs為(1×106個(gè)細(xì)胞，100μ1)C組：注射經(jīng)Ad-ADM轉(zhuǎn)染的MSCs(1×106個(gè)細(xì)胞，100μ1)為D組；4周后采用左心室插管和多普勒超聲診斷儀檢測(cè)大鼠的心功能

5、；天狼猩紅染色檢測(cè)膠原含量，用偏振光顯微鏡分析Ⅰ/Ⅲ型膠原比率：熒光顯微鏡觀察移植細(xì)胞在心臟存活及分布；免疫組化檢測(cè)ADM在心肌梗死區(qū)的表達(dá)，Ⅷ免疫組化檢測(cè)心梗區(qū)新生血管密度；Troponin I(TNI)、connexin43免疫組化檢測(cè)移植細(xì)胞在心肌梗死區(qū)的分化及表達(dá)情況。 結(jié)果：與對(duì)照組及其它組相比，ADM基因修飾的MSCs組心肌梗死區(qū)ADM的表達(dá)增加；與對(duì)照組比較，單純細(xì)胞移植組心梗區(qū)新生血管密度增高(P<0.05)，c

6、onnexin43的表達(dá)增加(P<0.05)，梗塞區(qū)Ⅰ/Ⅲ型膠原比率降低(P<0.01)，并能改善心臟血流動(dòng)力學(xué)功能及EF值；與單純細(xì)胞組比較ADM基因修飾的MSCs移植組梗塞區(qū)新生血管密度增高(P<0.01)，connexin43的表達(dá)增加(P<0.05)，Ⅰ/Ⅲ型膠原比率降低更明顯(P<0.05)，而心臟血流動(dòng)力學(xué)功能及EF值改善更多；在各細(xì)胞移植組的心臟切片上均有DAPI標(biāo)記的移植細(xì)胞的存活；各細(xì)胞移植組移植細(xì)胞均表達(dá)TNI。