電刺激小腦頂核對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子及其受體的影響.pdf

1、新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是指在圍產(chǎn)期窒息缺氧等因素導(dǎo)致腦的缺氧缺血性損害，臨床上出現(xiàn)一系列腦病的表現(xiàn)。重度患兒常遺留腦癱、癲癇、智力障礙、共濟(jì)失調(diào)等后遺癥，給家庭和社會造成極大的負(fù)擔(dān)。因此，尋找有效的防治HIBD方法對于提高新生兒的存活率，降低致殘率，搞好優(yōu)生優(yōu)育，提高我國人口素質(zhì)，具有重要的意義。
　　 缺氧缺血后腦組織血運供應(yīng)的改善與神經(jīng)元功能的恢復(fù)密切相

2、關(guān)。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一組近年來新發(fā)現(xiàn)的血管新生因子，是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能細(xì)胞因子，也是血管發(fā)生和神經(jīng)營養(yǎng)因子，不僅能促進(jìn)血管的新生，還能直接作用于神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)的作用。
　　 目的
　　 近年來，物理治療方法如電刺激、功能訓(xùn)練、針灸、按摩等在腦缺血疾病的治療過程中越來越受到重視，而電刺激目前治療成年腦

3、缺血性疾病的療效已得到肯定，但對HIE恢復(fù)期的療效在國內(nèi)外卻少有報道，更缺少實驗證據(jù)。本實驗通過制作新生大鼠缺氧缺血性腦損傷模型，給予電刺激其小腦項核，利用免疫組化方法來觀察腦組織中VEGF及其受體的表達(dá)，并通過記憶能力測試，探討電刺激對腦保護(hù)作用的機制。
　　 材料與方法
　　 1.分組
　　 新生7日齡健康SD大鼠105只，雌雄不限，體重12-16g，隨機分成A、B兩組。每組又分為對照組、模型組、電刺激組，A

4、組各25只，B組各10只。A組在造模術(shù)后又按1天、3天、7天、14天、21天隨機分成5組，每組各5只。
　　 2.Rice法模型制作
　　 新生7日齡健康SD大鼠，乙醚吸入麻醉，取頸左側(cè)切口，游離左頸總動脈，用絲線結(jié)扎，縫合切口，置于缺氧箱中，持續(xù)充以氣流量為2L/min的8：92氧氮混合氣體2h。對照組僅分離出左側(cè)頸總動脈，不結(jié)扎也不缺氧。術(shù)后夾尾左旋是制模成功的標(biāo)志，據(jù)此納入實驗。
　　 3.電刺激治療方法<

5、br>　　 電刺激組在術(shù)后12 h開始刺激治療，每次電刺激30分鐘，刺激部位為耳后相當(dāng)于人乳突處，每日1次，電刺激強度為3.5V、頻率50HZ，使大鼠肢體稍有震顫為宜。對照組與模型組不予電刺激治療，僅予相應(yīng)時段捕捉固定。
　　 4.標(biāo)本采集與制備
　　 A組三組大鼠每組分別于術(shù)后1天、3天、7天、14天、21天隨機各取5只大鼠，應(yīng)用乙醚麻醉后，剪開胸腔，暴露心臟，剪開右心耳，以20ml注射器連接5號頭皮針經(jīng)左心室心尖部

6、先灌注9g/L鹽水50ml，然后灌注40g/L多聚甲醛溶液。沿頸部斷頭，眼科鑷剝離顱骨，離斷視神經(jīng)和延髓完整取出腦組織，取以海馬為中心的腦組織，40g/L多聚甲醛固定24h，將腦組織沿視交叉和正中隆起處做冠狀切開，分別做冠狀切片，進(jìn)行VEGF及VEGFR1、VEGFR2的免疫組化檢測，并對切片進(jìn)行病理學(xué)指標(biāo)的檢測。
　　 5.指標(biāo)測定
　　 5.1腦組織HE染色
　　 光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。
　　 5.2

7、腦組織VEGF及VEGFR1、VEGFR2的測定
　　 高倍光鏡下觀察大鼠海馬區(qū)VEGF及VEGFR1、VEGFR2陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)，胞核染成棕黃色者判為陽性表達(dá)產(chǎn)物。利用Image-pro plus6.0軟件系統(tǒng)對切片進(jìn)行平均光密度測定，每張切片隨機選取5個視野，取其平均值。
　　 5.3記憶能力測試
　　 采用Y迷宮實驗。于手術(shù)后第28天對B組各組大鼠進(jìn)行迷宮實驗測試，以連續(xù)10次測試中有9次正確的反應(yīng)為達(dá)到

8、學(xué)會的標(biāo)準(zhǔn)，記錄每一動物迷路分辨學(xué)習(xí)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)前所需要的測試數(shù)和正確反應(yīng)率。24 h后重復(fù)以上實驗的過程。
　　 6.統(tǒng)計學(xué)分析：
　　 采用SPSS for windows13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，方法為單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，數(shù)據(jù)均以x±s表示，以α=0.05為顯著性檢驗水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.HE染色結(jié)果：
　　 對照組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞排列整齊緊密，

9、細(xì)胞核清楚，核仁明顯，胞漿染色均勻，胞膜完整。模型組海馬區(qū)錐體細(xì)胞變性，細(xì)胞間隙增大，排列紊亂，正常神經(jīng)元減少，可見大量明顯的壞死灶，壞死中心區(qū)呈空泡樣變，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，胞質(zhì)皺縮，核濃縮深染，核仁消失，胞漿疏松，間質(zhì)水腫。電刺激組神經(jīng)細(xì)胞變性壞死較少，損傷程度明顯減輕，海馬區(qū)錐體細(xì)胞及神經(jīng)元存活數(shù)量多，多數(shù)細(xì)胞形態(tài)相對正常。
　　 2.VE6F、VE6FR1、VE6FR2免疫組化染色：
　　 電刺激組各個時間點VEG

10、F及VEGFR1、VEGFR2表達(dá)均高于模型組和對照組(P<0.05)；模型組各個時間點VEGF及VEGFR1、VEGFR2表達(dá)均高于對照組(P<0.05)；電刺激組和模型組VEGF表達(dá)于第3天達(dá)高峰，持續(xù)14天開始下降至21天仍有表達(dá)，VEGFR1、VEGFR2表達(dá)于第7天達(dá)到高峰，持續(xù)14天開始下降至21天仍有表達(dá)；對照組各個時間點的VEGF及VEGFR1、VEGFR2表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。
　　 3.記憶能力測試

11、：
　　 模型組大鼠第1天達(dá)標(biāo)所需反應(yīng)次數(shù)顯著多于對照組，正確反應(yīng)率顯著低于對照組，第2天復(fù)測仍有相似結(jié)果，而電刺激組第1天達(dá)標(biāo)所需反應(yīng)次數(shù)顯著低于模型組，正確反應(yīng)率也顯著高于模型組，各組相比均有顯著意義(P<0.05)；在模型組，第2天正確率未見明顯提高，與第1天相比P>0.05，余均見明顯提高(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.電刺激可促進(jìn)HIBD新生大鼠腦組織VEGF及其受體VEGFR1、VEGFR