Dot-ELISA檢測犬惡絲蟲抗體方法的建立及犬惡絲蟲可溶性蛋白的抗原性研究.pdf

1、犬惡絲蟲病是由犬惡絲蟲引起的呈世界性分布的寄生蟲病，該病嚴重影響犬貓及小熊貓、狼、狐等多種野生肉食動物的健康。 感染犬惡絲蟲病嚴重的動物有明顯的臨床癥狀，容易確診。而輕度感染、感染早期或夏季潛伏期病例卻較難發(fā)現(xiàn)，因此該病的早期診斷比較困難。目前國內關于犬惡絲蟲病診斷方面的報道主要是病原學診斷，而國外資料報道犬惡絲蟲的可檢測血清抗體水平往往比典型的臨床癥狀出現(xiàn)得早，且血清學診斷方法比臨床診斷方法有更高的檢出率，因此本研究用提取的可

2、溶性蛋白作為診斷抗原建立了檢測犬惡絲蟲病血清抗體的Dot-EIASA方法。診斷抗原是將收集的犬惡絲蟲經反復凍融、研磨、離心的方法獲得。通過反復篩選，確定了該法的最佳反應條件：抗原最適包被濃度為16.41 μg/ml，包被溫度和時間為37℃30 min，封閉液為1％BSA.，封閉條件為37℃50 min，抗原抗體反應條件為37℃60 min，辣根過氧化酶標記的SPA(HRP-SPA)最適工作濃度為1:4000，孵育條件為37℃60 min

3、，底物作用時間為20 min，血清稀釋液和洗滌液均為0.01M pH7.4 PBST(含0.2％Tween-20)。阻斷試驗和交叉試驗表明診斷膜片具有良好的特異性：不與犬蠕形螨高免血清、犬鉤口線蟲高免血清、犬弓首蛔蟲血清等陽性血清反應；膜片具有良好的靈敏性，高免血清作1：2<'8>稀釋亦能檢出；重復性試驗表明該法重復性良好。診斷膜片保存期長，在4℃保存12個月其檢測活性不變。該方法操作簡便快捷，3.5小時內即可完成。結果表明Dot-EL

4、ISA簡便、快速、靈敏、特異，重復性好，結果客觀、穩(wěn)定，肉眼容易判定，不需要特殊儀器，診斷膜便于寄送、保存，各種試劑和材料都可作到標準化。Dot-ELISA為犬惡絲蟲病的診斷和流行病學調查提供了良好的技術手段。 為了尋找診斷犬惡絲蟲病的特異性抗原，本研究應用SDS-PAGE對提取的犬惡絲蟲可溶性抗原組分進行分析，然后用犬惡絲蟲高免血清、自然感染犬惡絲蟲血清和陰性血清進行免疫印跡(Western blot)。電泳結果表明提取的粗抗