西酞普蘭預(yù)處理對慢性應(yīng)激大鼠探究行為、空間記憶及腦內(nèi)信號分子ERK1-2、CREB磷酸化水平的影響.pdf

1、隨著社會(huì)的發(fā)展和各方面競爭壓力的增加，負(fù)性應(yīng)激，特別是負(fù)性心理應(yīng)激已成為一個(gè)不可忽視的因素威脅著人們的健康。超過個(gè)體承受能力的負(fù)性心理應(yīng)激，往往是多種疾病的根源，特別是精神疾患，如抑郁癥。因此，研究負(fù)性心理應(yīng)激的中樞機(jī)制及抗應(yīng)激藥物的生物學(xué)效應(yīng)對應(yīng)激相關(guān)性精神障礙的防治具有十分重要的意義。然而，與心理社會(huì)應(yīng)激相關(guān)的中樞環(huán)路及抗應(yīng)激藥物的作用機(jī)制目前尚未完全明確，是現(xiàn)今醫(yī)學(xué)有待解決的重要問題之一。 已知細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶( ext

2、racellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)是促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）家族中的重要成員，該家族的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生長、增殖、分化和存活起關(guān)鍵作用。近年來發(fā)現(xiàn)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子ERK1/2 在應(yīng)激誘發(fā)的腦內(nèi)神經(jīng)元活動(dòng)中具有重要作用，其磷酸化已被作為一個(gè)新的神經(jīng)元活動(dòng)的標(biāo)志物用于功能形態(tài)學(xué)研究。而環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)單

3、元結(jié)合蛋白（cAMPresponse element binding protein, CREB）是一種重要的核蛋白，屬于結(jié)構(gòu)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子CREB 家族成員之一，其調(diào)節(jié)啟動(dòng)子中具有環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)單元(cAMP response element，CRE)的基因轉(zhuǎn)錄。這種核轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)節(jié)包括學(xué)習(xí)記憶在內(nèi)的廣泛的生物學(xué)功能，是細(xì)胞內(nèi)多種信號通路的一種關(guān)鍵成分。 包括環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophospha

4、te, cAMP）通路、Ras/ERK 通路等在內(nèi)的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均涉及CREB 的磷酸化及其活化作用。CREB是一個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄活化劑，其表達(dá)和/或活性的變化，會(huì)影響包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）在內(nèi)的多種下游靶基因的調(diào)節(jié)，從而影響抗心境障礙藥物的總體效應(yīng)。 本研究在建立大鼠慢性束縛應(yīng)激模型的基礎(chǔ)上，運(yùn)用曠場試驗(yàn)、Morris水迷宮等行為學(xué)方法及蛋白免疫

5、印跡分析（Western blot）和免疫組織化學(xué)方法，探討大鼠慢性束縛應(yīng)激后探究行為、空間記憶能力的改變及腦內(nèi)應(yīng)激相關(guān)核團(tuán)ERK1/2、CREB 磷酸化水平的變化；同時(shí)觀察應(yīng)激前和應(yīng)激期間預(yù)防性給予5-羥色胺再攝取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitor, SSRIs）－西酞普蘭（citalopram）對大鼠上述變化的影響，為闡明負(fù)性應(yīng)激中樞機(jī)制提供理論依據(jù)，并為臨床治療及預(yù)防應(yīng)激相關(guān)精神障

6、礙時(shí)選擇藥物提供新思路。 目的： 1. 單純及預(yù)防性給予大鼠SSRIs對其探究行為、空間記憶能力的影響。 2. 慢性束縛應(yīng)激大鼠額前葉皮質(zhì)（prefrontal cortex, PFC）中磷酸化ERK1/2（phosphorylated-ERK1/2, p-ERK1/2）、總ERK1/2 水平的變化。 3. 應(yīng)激前和應(yīng)激期間預(yù)防性給予SSRIs 對大鼠腦內(nèi)應(yīng)激相關(guān)核團(tuán)中ERK1/2、CREB 磷酸化水平的

7、影響。 方法： 1. 單純及預(yù)防性給予大鼠SSRIs 對其探究行為、空間記憶能力的影響雄性SD 大鼠隨機(jī)分為4 組：正常對照組（normal control, NC, N=6），束縛應(yīng)激組（restraint stress, RS, N=6），單純西酞普蘭組（only citalopram, OC,N=6）及西酞普蘭預(yù)處理組（citalopram prophylaxis, CP, N=6）。RS 組動(dòng)物腹腔內(nèi)注射(int

8、raperitoneal, I.p.)生理鹽水，1 ml/d，OC 組和CP 組動(dòng)物腹腔內(nèi)注射西酞普蘭，10 mg/(kg?d)，連續(xù)7 d。然后對RS 組和CP 組動(dòng)物均給予束縛應(yīng)激，方法為每天9:00-15:00 將大鼠置于特制的束縛器內(nèi)限制其行動(dòng)自由，連續(xù)21d。在束縛期間禁食，禁水。應(yīng)激期間RS 組和CP 組每日束縛前分別給予生理鹽水和西酞普蘭，OC 組相同時(shí)間給予西酞普蘭，劑量同束縛應(yīng)激前。NC 組和OC 組動(dòng)物僅在其它兩組動(dòng)

9、物每日應(yīng)激相應(yīng)時(shí)間也禁食，禁水，未進(jìn)行束縛應(yīng)激處理。束縛應(yīng)激結(jié)束后當(dāng)日對大鼠進(jìn)行曠場測試；束縛實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 w 開始利用Morris 水迷宮對大鼠進(jìn)行空間記憶訓(xùn)練，束縛應(yīng)激結(jié)束當(dāng)日對大鼠進(jìn)行空間記憶能力測試。 2. 慢性束縛應(yīng)激大鼠PFC 中p-ERK1/2、總ERK1/2 水平的變化雄性SD 大鼠隨機(jī)分為2 組： NC 組（N=3），RS 組（N=3）。實(shí)驗(yàn)方法同1。束縛應(yīng)激結(jié)束后，所有大鼠迅速斷頭處死。觀察兩組大鼠PFC 中

10、p-ERK1/2 和總ERK1/2 水平的變化。 3. 預(yù)防性給予SSRIs 對大鼠腦內(nèi)應(yīng)激相關(guān)核團(tuán)中ERK1/2、CREB 磷酸化水平的影響雄性SD 大鼠隨機(jī)分為3 組： NC 組（N=6），RS 組（N=6）及CP 組（N=6）。 各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法同1。束縛應(yīng)激結(jié)束后，所有大鼠立即處死。觀察各組大鼠腦內(nèi)應(yīng)激相關(guān)腦區(qū)、核團(tuán)中ERK1/2、CREB 磷酸化水平的變化。 結(jié)果： 1. 單純及預(yù)防性給予大鼠S

11、SRIs 對其探究行為、空間記憶能力的影響經(jīng)過21 d 慢性束縛應(yīng)激后，與NC 組相比， RS 組大鼠曠場試驗(yàn)的水平活動(dòng)度明顯減少，中央停留時(shí)間明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）； OC 組大鼠的曠場試驗(yàn)行為沒有明顯變化。CP 組大鼠曠場試驗(yàn)的水平活動(dòng)度較RS 組顯著增加，中央時(shí)停留間則明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 經(jīng)過21 d 慢性束縛應(yīng)激后，與NC 組相比，RS 組大鼠的目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間和穿越

12、站臺(tái)次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；OC 組大鼠的檢測結(jié)果無明顯變化。CP 組大鼠目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間和穿越站臺(tái)次數(shù)較RS 組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 2. 慢性束縛應(yīng)激大鼠PFC 中p-ERK1/2、總ERK1/2 水平的變化RS 組大鼠PFC 中p-ERK1/2 水平較NC 組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而總ERK1/2 的水平?jīng)]有明顯改變。 3. 預(yù)防性給予SSRIs 對大

13、鼠腦內(nèi)應(yīng)激相關(guān)核團(tuán)中ERK1/2、CREB 磷酸化水平的影響p-ERK1/2 陽性細(xì)胞在NC 組大鼠腦內(nèi)分布較為廣泛，我們著重觀察了一些與應(yīng)激相關(guān)的腦區(qū)、核團(tuán)。在PFC、杏仁內(nèi)側(cè)核（medial amygdaloid nucleus,MeA）、杏仁皮質(zhì)后內(nèi)側(cè)核（posteromedial cortical amgydala nucleus, PMCo）、隔區(qū)的外側(cè)核腹側(cè)部（lateral septal nucleus, ventral

14、part, LSV）及終紋床核（bednucleus of the stria terminalis, BNST）均有較多p-ERK1/2 陽性細(xì)胞分布。RS組大鼠的PFC、MeA、PMCo、LSV 及BNST 中p-ERK1/2 陽性細(xì)胞數(shù)較NC組明顯減少，細(xì)胞染色較淺，突起染出少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 CP 組大鼠在以上各腦區(qū)、核團(tuán)中p-ERK1/2 陽性細(xì)胞數(shù)較RS 組明顯增多，細(xì)胞染色濃，突起染出多，差異有

15、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同樣，磷酸化CREB（phosphorylated-CREB, p-CREB）陽性細(xì)胞在NC組大鼠腦內(nèi)分布也較為廣泛。其中PFC 內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)量多，位于皮質(zhì)淺層。 海馬齒狀回（DG）、杏仁中央核（central amygdaloid nucleus, CeA）、MeA 和PMCo 也有較多的p-CREB 陽性細(xì)胞表達(dá)。RS 組大鼠在上述腦區(qū)、核團(tuán)中p-CREB 陽性細(xì)胞數(shù)較NC 組明顯減少，染色淺，

16、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 CP 組大鼠在以上各腦區(qū)、核團(tuán)中p-CREB 陽性細(xì)胞數(shù)較RS 組明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論： 1. 慢性束縛應(yīng)激后大鼠的探究行為及空間記憶明顯受損；應(yīng)激前和應(yīng)激期間預(yù)防性給予西酞普蘭處理，能明顯緩解應(yīng)激對大鼠行為學(xué)改變造成的不良影響而發(fā)揮抗負(fù)性應(yīng)激作用；而單純給予大鼠西酞普蘭沒有影響大鼠在曠場及Morris 水迷宮中的表現(xiàn)。 2. 慢性束縛應(yīng)激

17、后大鼠PFC 內(nèi)p-ERK1/2 水平明顯降低，而總ERK1/2 水平?jīng)]有改變，提示信號分子ERK1/2 磷酸化可能與負(fù)性應(yīng)激的中樞機(jī)制有關(guān)。 3. 慢性束縛應(yīng)激改變了大鼠PFC、CeA、MeA、PMCo、DG 、LSV 及BNST等部位ERK1/2 及CREB 磷酸化的水平，這一結(jié)果提示上述腦區(qū)、核團(tuán)可能與負(fù)性應(yīng)激的中樞調(diào)控有關(guān)，而ERK1/2、CREB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了其調(diào)控過程；預(yù)防性給予大鼠西酞普蘭能夠增加上述腦區(qū)、核