海洋巨大芽孢桿菌抑制黃曲霉毒素生物合成及其機(jī)制.pdf

1、黃曲霉是糧食作物在生長(zhǎng)和貯存過(guò)程中存在的一種主要真菌。黃曲霉會(huì)產(chǎn)生毒性極強(qiáng)的黃曲霉毒素，影響人類和動(dòng)物的健康，對(duì)農(nóng)業(yè)、商業(yè)都產(chǎn)生極大的影響，并具有致癌、致突變、免疫抑制、致畸形等作用。世界各國(guó)投入了大量的人力和物力致力于黃曲霉毒素的降解等相關(guān)技術(shù)研究。生物防治的方法由于高效率、環(huán)境污染小、效果顯著而更受青睞。本研究利用從海洋中分離出的巨大芽孢桿菌抑制黃曲霉生長(zhǎng)及黃曲霉毒素產(chǎn)生，并采用基因芯片分析的方法來(lái)檢測(cè)抑制黃曲霉形成黃曲霉毒素的基因

2、表達(dá)途徑，這對(duì)降低黃曲霉毒素含量的研究具有重要意義。
　　(1)分別在UF715133-1和Jinhua1012兩種花生仁上接種海洋巨大芽孢桿菌和黃曲霉共培養(yǎng)，測(cè)定海洋巨大芽孢桿菌對(duì)黃曲霉毒素的生物合成和基因表達(dá)的影響。提取黃曲霉毒素并用HPLC分析毒素含量，再用KEGG和qRT-PCR對(duì)基因進(jìn)行分類和分析。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)組Jinhual012和UF715133-1中，超過(guò)85％的黃曲霉毒素B1合成被抑制，還有一些編碼蛋白酶的基

3、因，如短鏈脫氫酶、非核糖體多肽合成酶等顯著下調(diào)。因此，從海洋中分離出的巨大芽孢桿菌可顯著抑制黃曲霉毒素在花牛仁上的合成，黃曲霉中多種基因的表達(dá)受到抑制，但這些基因在黃曲霉毒素生物合成中的作用尚未闡明，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。
　　(2)分別在PDB和MM兩種液體培養(yǎng)基，接種海洋巨大芽孢桿菌與黃曲霉共培養(yǎng)，測(cè)定海洋巨大芽孢桿菌對(duì)黃曲霉毒素的生物合成和基因表達(dá)的影響。提取黃曲霉毒素并用HPLC分析毒素含量，再用KEGG和qRT

4、-PCR的方法對(duì)基因進(jìn)行分類和分析。結(jié)果表明，在PDB培養(yǎng)基和MM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的黃曲霉，所累積的黃曲霉毒素幾乎完全（分別減少99.75％和99.80％）被海洋巨大芽孢桿菌抑制了，生物量也分別比對(duì)照組生物量減少81.15％和74.67％。說(shuō)明通過(guò)與海洋巨大芽孢桿菌共培養(yǎng)抑制了黃曲霉的生長(zhǎng)，同時(shí)也抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生。基因芯片數(shù)據(jù)顯示，在PDB和MM培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)組，CPA生物合成的相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)。
　　(3)本實(shí)驗(yàn)從黃曲霉DNA選取3

5、段探針，分別在5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記，DNA探針長(zhǎng)度大約為400bp。海洋巨大芽孢桿菌在37℃搖床培養(yǎng)24小時(shí)進(jìn)行增殖;再以高速離心收集上清液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，用冷凍干燥器干燥，得到的粗提蛋白與PCR擴(kuò)增后的生物素標(biāo)記DNA探針相互作用，在非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行凝膠電泳，后經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移，采用化學(xué)發(fā)光EMSA試劑盒，對(duì)BiotinDNA-蛋白質(zhì)用化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)，確定結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果表明，探針3與海洋巨大芽孢桿菌代謝產(chǎn)物結(jié)合并出現(xiàn)遷移