雞毒霉形體黏附素特性鑒定及其雞胚組織互作蛋白的分布研究.pdf

1、雞毒霉形體(Mycoplasmagallisepticum,MG)是雞慢性呼吸道病的病原菌。本病在世界各地的雞群中普遍存在，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。許多研究表明，MG通過表面的黏附素(ProteinMycoplasmaGallisepticumAdheain,pMGA)與雞呼吸道粘膜表面的受體結(jié)合而侵染宿主。為了闡明pMGA的結(jié)構(gòu)、功能及其在雞毒霉形體感染中的分子致病機(jī)制，本研究鑒定了雞毒霉形體黏附素特性、探討了pMGA與宿主受體分

2、子的相互作用及受體在雞組織中的分布規(guī)律，為進(jìn)一步研究雞體內(nèi)pMGA受體基因的類型、分子結(jié)構(gòu)及作用方式奠定了基礎(chǔ)，取得了如下結(jié)果。 1.雞毒霉形體黏附素特性鑒定 通過生物學(xué)軟件及相關(guān)在線分析工具，對pMGA進(jìn)行基于氨基酸序列的生物信息學(xué)分析，包括蛋白質(zhì)理化特性、功能域、磷酸化位點(diǎn)、基序及空間結(jié)構(gòu)等。分析表明，pMGA1.2主要在細(xì)胞外發(fā)揮生物學(xué)作用，分子量64.9kD，理論等電點(diǎn)為5.58，半衰期體外培養(yǎng)的哺乳動物網(wǎng)狀細(xì)胞

3、為30h，酵母菌體內(nèi)20h以上，大腸桿菌體內(nèi)10h以上；a螺旋占26.59％，主要存在于210位氨基酸之前；β折疊占23.08％，存在于210位氨基酸之后，無規(guī)卷曲占50.33％，該蛋白為穩(wěn)定的球狀蛋白質(zhì)；pMGA1.2分子有6類基序模式，53個基序位點(diǎn)和21個抗原決定簇，而且有4處具有明顯的卷曲螺旋；pMGA1.2含有5個結(jié)構(gòu)域，分別為蛋白家族Myco_haema結(jié)構(gòu)域、2個FIVAR結(jié)構(gòu)域、C末端有1個甲基化-DNA-蛋白半胱氨酸甲

4、基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和1個半乳糖結(jié)合區(qū)；pMGA1.2屬于霉形體血凝素超家族的一員，與霉形體R株黏附蛋白相似度高達(dá)99％。 2.雞毒霉形體黏附素截短蛋白及全蛋白表達(dá)產(chǎn)物免疫學(xué)特性鑒定 對pMGA1.2和pMGAIV片段基因原核表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得了pMGA1.2及pMGAIV可溶性表達(dá)的最佳條件。pMGA1.2表達(dá)量在裂解液全菌體和上清液中分別達(dá)18.5％和17％，pMGAIV表達(dá)量在裂解液全菌體和上清液中分別達(dá)28％和18

5、％。采用GST親和層析柱純化pMGA1.2及pMGAIV，純度達(dá)95％左右。免疫印跡結(jié)果表明，pMGA1.2和pMGAIV融合蛋白能與兔源雞毒霉形體陽性血清發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，出現(xiàn)明顯的顯色條帶；空載體對照無顯色條帶；表明本實驗所獲得的pMGA1.2及pMGAIV融合蛋白均具有良好的免疫學(xué)活性。 3.免疫熒光檢測pMGA受體在雞胚組織中的分布 用蛋白酶thrombin切去融合蛋白pMGA1.2的GST標(biāo)簽，獲得純化的pM

6、GA1.2，建立了檢測雞胚組織中pMGA受體的間接免疫熒光組織化學(xué)方法。將20日齡SPF雞胚的氣管、心、肺、肝、腎、十二指腸、法氏囊、腺胃、胸腺和脾臟等組織制成石蠟切片，采用純化的pMGA1.2與各組織作用，用兔源的MG陽性血清和FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG來檢測受體分布。結(jié)果表明：除脾臟外，其他組織中均出現(xiàn)明亮的特異性熒光，說明這些組織可能均存在能與pMGA1.2特異性結(jié)合的蛋白即受體蛋白。其中，pMGA的受體分布于氣管和十二指腸的纖毛

7、上皮細(xì)胞，肺臟的肺泡上皮細(xì)胞，法氏囊盲突的淋巴小結(jié)的皮質(zhì)區(qū)，胸腺的皮質(zhì)部，腺胃的粘膜層，肝臟、心臟及腎臟中pMGA受體的位置暫時無法確定。 4.雞胚組織膜蛋白與雞毒霉形體黏附素特異結(jié)合的研究 采用差速離心提取雞胚組織膜蛋白，經(jīng)處理后固定于硝酸纖維素膜上。以純化的pMGA1.2及pMGAIV為“靶蛋白”，用兔源MG陽性血清與羊抗兔酶標(biāo)IgG檢測雞胚各組織中是否存在能與pMGA反應(yīng)的組織蛋白；SDS-PAGE分析組織膜蛋白。