MMP1通路軸對乳腺癌轉移的研究.pdf

1、第一部分:MMP1導致高轉移細胞株的高轉移能力
　　目的:通過MDA-MB-231免疫缺陷小鼠乳房墊注射,獲取高轉移細胞株模型;通過對比高低轉移細胞體外及體內(nèi)實驗差別,尋找和建立可預測乳腺癌患者復發(fā)、轉移風險的蛋白質(zhì)譜系。
　　方法:(1)以MDA-MB-231免疫缺陷小鼠乳房墊注射,獲取高轉移細胞株;細胞傳代40代以上;做核型分析及微衛(wèi)星分析以確定細胞系種屬來源;(2)免疫缺陷鼠乳房墊注射行成瘤實驗;肺切片并行HE染色觀察

2、肺部腫瘤轉移情況;鏡下觀察細胞形態(tài);(3)以Transwell比較高低轉移細胞株間體外細胞轉移能力差異;以CCK8試劑盒行體外增殖實驗;(4)細胞胞漿蛋白雙向電泳;細胞上清蛋白超濾濃縮后行雙向電泳;蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析;WesternBlot實驗驗證;實時PCR確定細胞內(nèi)外mRNA表達水平差異;(5)MMP1的RNAi質(zhì)粒構建及穩(wěn)定轉染;V2M4細胞株MMP1基因沉默細胞株建立;穩(wěn)定轉染細胞株免疫缺陷鼠體內(nèi)注射觀察相關參數(shù)。
　　結果:

3、(1)成功從MDA-MB-231獲得高轉移細胞株V2M4;成功獲得V2M4子代高轉移細胞Vb;細胞穩(wěn)定傳代;細胞核型及微衛(wèi)星分析均可確定細胞為人源細胞;(2)1×106細胞注射免疫缺陷小鼠后,V2M4成瘤率在兩周時100％,Vb成瘤率在4周時100％,MDA-MB-231成瘤率在4周時為33％;成瘤平均體積V2M4為Vb的4倍,為MDA-MB-231的30倍以上;V2M4肺部轉移灶明顯,且數(shù)目繁多,Vb及MDA-MB-231幾乎沒有明顯

4、可見轉移灶;鏡下可見V2M4與Vb形態(tài)類似,與MDA-MB-231向比較明顯偏圓形。(3)細胞體外實驗結果表明,高、低轉移細胞在細胞侵襲實驗中差異沒有統(tǒng)計學差意義;高、低轉移細胞株在細胞增殖實驗中差異沒有統(tǒng)計學意義;(4)高、低轉移細胞株胞漿蛋白經(jīng)雙向電泳、質(zhì)譜分析后可發(fā)現(xiàn)約41個差異蛋白;上清蛋白濃縮后雙向電泳、質(zhì)譜分析后,發(fā)現(xiàn)可反復重復的差異蛋白只有MMP1;WesternBlot實驗證明高轉移細胞株胞漿內(nèi)MMP1蛋白表達量為低轉移

5、細胞株的2倍;而高轉移株細胞上清濃縮蛋白中MMP1蛋白表達量為為低轉移細胞株的1000倍以上,有顯著差異;實時PCR證明細胞內(nèi)MMP1的mRNA的表達差異介于胞漿蛋白與上清蛋白之間;(5)成功構建MMP1基因沉默質(zhì)粒并得到4個靶位,8個以上克隆,其中兩個(720與1052靶位點)基因沉默效率大于70％,穩(wěn)定轉染高轉移細胞株V2M4后行免疫缺陷鼠乳房墊注射后相關實驗結果,與體外實驗一致,注射MMP1基因沉默穩(wěn)轉細胞株的免疫缺陷鼠后成瘤率為

6、16.7％(1/6),肺轉移率為16.7％(1/6),而對照組空質(zhì)粒載體轉染的高轉移細胞株V2M4注射免疫缺陷鼠后成瘤率為100％(6/6),肺轉移率為100％(6/6)。
　　結論:(1)成功構建了具有遺傳穩(wěn)定性的乳腺癌高轉移細胞株V2M4。(2)證明V2M4細胞分泌的MMP1是決定細胞高轉移性的關鍵因子。(3)證明高、低轉移細胞株的MMP1的差異是在于分泌環(huán)節(jié)而不是表達水平。
　　第二部分:ACTA2調(diào)控的MMP1分泌是

7、引起乳腺癌高低轉移株差異的原因
　　目的:研究調(diào)控MMP1分泌的相關分子以及調(diào)控方式,為乳腺癌肺轉移的基礎和實驗研究提供靶點。
　　方法:(1)人乳腺癌細胞株MDA-MB-231與V2M4細胞總蛋白與MMP1特異性抗體做免疫共沉淀,尋找與MMP1直接作用的蛋白;質(zhì)譜分析所有免疫共沉淀蛋白并行westem驗證發(fā)現(xiàn)其中高低轉移株的差異蛋白(ACTA2);(2)以實時定量PCR檢測相關蛋白mRNA水平變化;(3)以激光共聚焦證明細

8、胞內(nèi)MMP1與ACTA2蛋白確實存在結合;(4)以蛋白表達證明及Pulldown實驗表明蛋白相互作用的直接性;(5)構建ACTA2基因沉默質(zhì)粒并穩(wěn)定轉染V2M4,進一步做western及實時定量PCR檢測MMP1的表達;進行細胞侵襲實驗及增殖實驗,三維凝膠實驗;免疫缺陷鼠乳房墊注射后觀察體內(nèi)成瘤及腫瘤肺轉移情況;(6).ACTA2病毒過表達載體構建,MDA-MB-435及MDA-MB-231轉染,流式細胞儀篩選穩(wěn)定轉染細胞,并行ACTA

9、2基因沉默質(zhì)粒構建并穩(wěn)定轉染V2M4進一步做western及實時PCR檢測MMP1表達情況,行細胞侵襲實驗及增殖實驗,三維凝膠實驗;(7)利用含鈣及無鈣DMEM培養(yǎng)基檢測鈣對MMP1分泌的影響;(8)構建肌動蛋白特異性載體(pro-50)檢測ACTA2聚合與解聚對MMP1分泌的影響;篩選鈣特異性配體門控通道,得到TRPV6表達差異;(9)構建TRPV6基因沉默載體并穩(wěn)定轉染Vb行體內(nèi)體外實驗證明鈣通道對MMP1分泌的影響;以TRPV6的

10、興奮劑與抑制劑進一步驗證實驗結果。
　　結果:(1)V2M4和MDA-MB-231經(jīng)過MMP1免疫共沉淀與質(zhì)譜分析,得到六相互作用蛋白:GRP75/GRP78/HSP70/ACTA2/ACTB/βtublin;(2)六種蛋白中ACTA2的mRNA表達及蛋白表達的水平在V2M4與MDA-MB-231中有1000倍以上的差異,其他5個相互作用的蛋白在V2M4與MDA-MB-231均無顯著性差異;(3)激光共聚焦實驗表明,ACTA2在V

11、2M4中呈彌散性分布,在MDA-MB-231中呈現(xiàn)細胞核內(nèi)聚積分布,ACTA2與MMP1在V2M4中有明顯的重疊分布,在MDA-MB-231細胞中分布無明顯的重疊區(qū)域;(4)在細菌中成功表達人源GST-ACTA2,并通過pull-down實驗中與外源性MMP1可相互沉淀;(5)成功構建ACTA2基因沉默細胞株V2M4-shRNA380與shRNA1126,行westernblot檢測,結果表明ACTA2基因沉默會大幅下調(diào)ACTA2的mR

12、NA及蛋白水平表達,并大幅下調(diào)細胞上清中MMP1的分泌水平,但不影響細胞漿中MMP1的mRNA水平及蛋白水平的表達;(6)ACTA2基因沉默細胞比MDA-MB-231細胞三維凝膠實驗中對I型膠原的侵蝕明顯增強,但細胞本身的侵襲實驗沒有差異,增殖實驗也沒有差異;(7)以V2M4在無鈣與含鈣培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后,含鈣培養(yǎng)基中MMP1正常分泌,無鈣培養(yǎng)基中無分泌;(8)EEED-pro-50中細胞培養(yǎng)MMP1明顯高于DEDE-pro-50,這

13、種作用可以被BredfelinA抑制;以實時定量PCR確定V2M4細胞與MDA-MB-231中TRPV6與TRPV1有差異,其中Vb與MDA-MB-231比較,TRPV6的RNA表達有1000倍以上差異:(9)TRPV6基因沉默穩(wěn)定轉染細胞株以及激動劑、抑制劑實驗均支持TRPV6對MMP1分泌起主動調(diào)控作用。
　　結論:(1)明確了MMP1分泌與ACTA2表達直接相關;(2)MMP1分泌與ACTA2聚合與解聚相關;ACTA2調(diào)控M

14、MP1分泌必須通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體;(3)ACTA2在自然狀態(tài)中對MMP1的調(diào)控作用高度依賴于鈣離子通道,其TRPV6最為重要。
　　第三部分:MMP1/ACTA2/PARI通路軸與臨床病例T分級高度相關
　　目的:建立MMP1/ACTA2/PAR1通路軸,為乳腺癌肺部晚期轉移的靶向治療開辟新的途徑。
　　方法:收集260例復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院2002-2008年度病人原位腫瘤切除后標本,提取RNA、測定mRNA質(zhì)量并

15、行逆轉錄;按照TNM分期方法將病例標本分為T1組、T2組和T3組;以實時定量PCR方法檢測標本中MMP1、ACTA2、PAR1、TRPV6的mRNA表達水平。
　　結果:三組標本中,MMP1、ACTA2、PAR1、TRPV6的mRNA表達水平無顯著差異;利用delta-ct加和法統(tǒng)計后有顯著差異;TRPV6表達在三組標本中接近一恒定值,均高于正常標本與良性腫瘤標本。
　　結論:MMP1/ACTA2/PAR1/TRPV6為:M