HMGB1在PRRSV感染中的作用及Glycyrrhizin抗PRRSV活性研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬，是豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)的病原。PRRS是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病，典型特征表現(xiàn)為嚴(yán)重的間質(zhì)性肺炎。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是一種重要的內(nèi)源性危險信號分子，在誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)中扮演重要角色。研究表明，HMGB1參與多種傳染性疾病的致病過程。Badaoui等提出HMGB1可能是PRRSV操縱宿主免疫反應(yīng)的一個靶標(biāo)，但其

2、具體作用機(jī)制目前尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)HMGB1不影響PRRSV的復(fù)制，但是能增強(qiáng)PRRSV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。具體研究結(jié)果如下:
　　1.PRRSV感染仔豬后HMGB1的表達(dá)升高
　　將PRRSV感染PRRSV陰性仔豬，通過real-timeRT-PCR和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，PRRSV感染仔豬后HMGB1的表達(dá)量升高，而且通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)血清中HMGB1的含量與病毒載量，以及TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6和IL-

3、8的表達(dá)具有正相關(guān)性。
　　2.PRRSV感染誘導(dǎo)HMGB1的出核，并促進(jìn)其釋放
　　利用間接免疫熒光試驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)PRRSV感染MARC-145細(xì)胞和PAM細(xì)胞均能誘導(dǎo)HMGB1從細(xì)胞核釋放到細(xì)胞漿。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)PRRSV感染MARC-145和PAM細(xì)胞均能促進(jìn)HMGB1分泌至細(xì)胞外，且呈劑量依賴性，而紫外滅活的PRRSV不能促進(jìn)HMGB1的釋放，表明HMGB1的釋放與PRRSV的復(fù)制密切相關(guān)。
　　3.HMGB

4、1對PRRSV的增殖無顯著影響
　　用HMGB1的干擾分子、HMGB1的中和抗體以及純化的HMGB1蛋白分別轉(zhuǎn)染或者處理MARC-145細(xì)胞后接種PRRSV，于接毒后不同時間收集樣品。通過Westernblot和空斑試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，干擾HMGB1基因、細(xì)胞培養(yǎng)液中添加HMGB1的中和抗體和純化的HMGB1蛋白，對PRRSVNSP2蛋白的表達(dá)和病毒滴度均無顯著影響，說明HMGB1不影響PRRSV的增殖。
　　4.HMGB1增強(qiáng)P

5、RRSV誘導(dǎo)的NF-κB的活化
　　用HMGB1的干擾分子轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞后接種PRRSV，通過NF-κB熒光素酶報告系統(tǒng)和Westernblot試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干擾HMGB1的表達(dá)能顯著抑制PRRSV誘導(dǎo)的NF-κB激活和NF-κBp65亞基的磷酸化。用純化的HMGB1蛋白處理PRRSV感染的MARC-145細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HMGB1能增強(qiáng)PRRSV誘導(dǎo)的NF-κB的活化和NF-κBp65亞基的磷酸化。
　　5.HMGB1上調(diào)P

6、RRSV誘導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)
　　為了探討HMGB1是否參與PRRSV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，將HMGB1干擾分子轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞或者PAM細(xì)胞后接種PRRSV，通過real-timeRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)干擾HMGB1的表達(dá)能抑制PRRSV誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6、IL-8、RANTES和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)。并且利用純化的HMGB1蛋白處理MARC-145細(xì)胞或者PAM細(xì)胞能上調(diào)PRRSV誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6、IL

7、-8、RANTES和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)。以上結(jié)果提示HMGB1在PRRSV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中扮演重要角色。
　　6.HMGB1受體參與PRRSV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)
　　為了進(jìn)一步探討HMGB1受體是否也參與PRRSV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，將HMGB1受體(RAGE，TLR2，TLR4，TLR9)的干擾分子轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞，利用NF-κB熒光素酶報告系統(tǒng)和real-timeRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)干擾RAGE、TLR2和TLR

8、4的表達(dá)能顯著降低NF-κB的活性以及IL-1β、IL-6、IL-8、RANTES和TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)，提示HMGB1可能通過RAGE、TLR2和TLR4信號通路激活NF-κB，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。
　　7.Glycyrrhizin抑制PRRSV的增殖
　　Glycyrrhizin是從甘草根部提取的天然成分。將glycyrrhizin以不同濃度處理細(xì)胞，結(jié)果證實(shí)glycyrrhizin能夠顯著抑制PRRSV的復(fù)制和PR