基于1H-NMR技術(shù)對(duì)道地藥材黃柏和澤瀉質(zhì)量控制的代謝組學(xué)研究.pdf

1、中藥是復(fù)雜混合物體系，由于其基源繁多，產(chǎn)地各異，作用機(jī)制復(fù)雜，生產(chǎn)炮制加工的多樣性等因素，使得中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)是中藥研究中的難點(diǎn)。基于中醫(yī)理論的整體觀念和隨著現(xiàn)代分析化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，色譜指紋圖譜技術(shù)已廣泛用于中藥材及其制劑的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)，尤其1H-NMR指紋圖譜能夠同時(shí)檢測(cè)植物的初生和次生代謝產(chǎn)物，是全組分研究不可或缺的方法。
　　多產(chǎn)地或多基源品種是道地藥材質(zhì)量控制的難點(diǎn)，且目前對(duì)澤瀉、黃柏的質(zhì)量控制的方式單一，多采用HPL

2、C法測(cè)定藥材中單個(gè)或多個(gè)有效成分的含量，不足以體現(xiàn)中藥材多組分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，急需尋求新的質(zhì)量控制方法對(duì)不同產(chǎn)地澤瀉藥材以及不同品種黃柏藥材進(jìn)行系統(tǒng)研究。本實(shí)驗(yàn)室前期已將1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)成功運(yùn)用于黃連、藏茵陳的品種鑒別與品質(zhì)評(píng)價(jià)研究，本文將1H-NMR的代謝組學(xué)技術(shù)用于區(qū)分澤瀉產(chǎn)地、鑒別黃柏品種，旨在加強(qiáng)道地藥材黃柏、澤瀉的質(zhì)量控制。
　　目的：
　　以道地藥材澤瀉和黃柏為研究對(duì)象，采用1H-NMR的代謝組學(xué)方法，研

3、究不同產(chǎn)地、不同品種間藥材代謝物的差異和進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，為澤瀉藥材產(chǎn)地的判別、黃柏藥材的品種鑒定以及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.采用1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)，建立澤瀉藥材Alismaorientalis(Sam.) Juzep.和黃柏藥材（黃皮樹(shù)PhellodendronchinenseSchneid.、禿葉黃皮樹(shù)P.chinensevar. glabriusculum Schneid.、黃檗P. amuren

4、se Rupr.）的整體代謝物指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)中的主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）方法，以揭示藥材整體代謝物差異。
　　2.采用HPLC法測(cè)定川黃柏與關(guān)黃柏藥材中小檗堿、黃柏酮等5個(gè)有效成分的含量，并結(jié)合方差分析，驗(yàn)證1H-NMR代謝組學(xué)分析結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　1.從澤瀉提取物中鑒定了4個(gè)成分：23-乙酰澤瀉醇B（δ2.09,3H, s,-OAc;δ1.15,3H, s, H-18

5、）、蔗糖（5.39, d, H-1）、β-半乳糖（δ4.52, d, H-1）、丙氨酸（δ1.47, d,-CH3）。通過(guò)PCA、PLS-DA分析，能有效區(qū)分4個(gè)不同產(chǎn)地澤瀉藥材；經(jīng)核磁定量分析，澤瀉藥材中4個(gè)代謝成分（23-乙酰澤瀉醇B、蔗糖、β-半乳糖、丙氨酸的相對(duì)含量分別為0.07％～0.19%，0.67%～6.58%，0.20%～0.56%，0.09%～0.18%。以23-乙酰澤瀉醇B為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)四川產(chǎn)地的澤瀉藥材中含有

6、最多的23-乙酰澤瀉醇B，相對(duì)含量高達(dá)0.19%，因此判斷其質(zhì)量最佳。
　　2.從川黃柏和關(guān)黃柏提取物中鑒定了11個(gè)成分：小檗堿、巴馬汀、綠原酸、阿魏酸、黃柏酮、木蘭花堿、黃柏堿、蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖、飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸。PCA、PLS-DA得分圖顯示川黃柏與關(guān)黃柏藥材有明顯的區(qū)分效果，而川黃柏的2個(gè)基源品種黃皮樹(shù)與禿葉黃皮樹(shù)聚集一起，不能有效區(qū)分。通過(guò)載荷圖分析發(fā)現(xiàn)關(guān)黃柏中含有更多的木蘭花堿、巴馬汀、黃柏酮、飽和脂

7、肪酸和不飽和脂肪酸以及部分未鑒定的糖；川黃柏中含有更多的小檗堿、黃柏堿、阿魏酸、咖啡酸和綠原酸。部分代謝產(chǎn)物被選擇手動(dòng)積分，進(jìn)行定量分析，川黃柏中小檗堿、黃柏堿、咖啡酸、綠原酸、蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖的相對(duì)含量分別為：3.47%、0.44%、0.20%、2.02%、1.30%、0.32%、0.42%；關(guān)黃柏中小檗堿、巴馬汀、黃柏堿、黃柏酮、綠原酸、蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖的相對(duì)含量分別為：0.50%、0.33%、0.15%、0

8、.15%、0.52%、1.58%、0.36%、0.50%。
　　3. HPLC含量測(cè)定結(jié)果為：川黃柏中小檗堿、黃柏堿、木蘭花堿的含量分別為5.40%、0.46%、0.11%；關(guān)黃柏中小檗堿、黃柏堿、木蘭花堿、巴馬汀、黃柏酮的含量分別為：0.44%、0.09%、0.31%、0.31%、0.18%。經(jīng)過(guò)方差分析，黃柏堿、木蘭花堿、巴馬汀、小檗堿、黃柏酮5個(gè)成分在川黃柏與關(guān)黃柏中具有顯著性差異，這與1H-NMR代謝組學(xué)化學(xué)計(jì)量學(xué)分析結(jié)果

9、一致。
　　結(jié)論：
　　1.四個(gè)不同產(chǎn)地的澤瀉藥材代謝產(chǎn)物有明顯差異，23-乙酰澤瀉醇B、蔗糖、β-半乳糖、丙氨酸成為澤瀉藥材地緣區(qū)分的差異代謝物。以23-乙酰澤瀉醇B為評(píng)價(jià)指標(biāo)，四川產(chǎn)地澤瀉藥材質(zhì)量最佳，與傳統(tǒng)上認(rèn)為四川為澤瀉的道地產(chǎn)區(qū)相符。
　　2.川黃柏與關(guān)黃柏藥材代謝產(chǎn)物有明顯差異。小檗堿、巴馬汀、黃柏堿、木蘭花堿、黃柏酮、阿魏酸、咖啡酸和綠原酸成為區(qū)分川黃柏與關(guān)黃柏藥材的差異代謝物；川黃柏藥材的2個(gè)基源品種（