生長(zhǎng)因子在肌腱損傷愈合早期中的表達(dá)變化及轉(zhuǎn)基因治療肌腱損傷的初步研究.pdf

1、目的： (1)檢測(cè)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、類胰島素生長(zhǎng)因子1(IGF-1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF-B)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)在肌腱損傷愈合早期的mRNA水平變化規(guī)律和TGF-β，bFGF和IGF-1在蛋白水平的表達(dá)變化。 (2)探索微量注射法以不同轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)基因至損傷肌腱的轉(zhuǎn)基因效率、分布和組織反應(yīng)。 (3)比較腺病毒(Ad

2、)、腺相關(guān)病毒(AAV)和脂質(zhì)體-質(zhì)粒(liposome-plasmid)三種轉(zhuǎn)基因載體在肌腱中的基因轉(zhuǎn)染效率并觀測(cè)腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)堿性成纖維細(xì)因子(bFGF)基因在肌腱愈合過(guò)程中表達(dá)。 (4)探討微小RNA導(dǎo)入肌腱細(xì)胞和損傷肌腱沉默轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFβ)基因的作用及對(duì)I型膠原、III型膠原和CTGF基因表達(dá)的影響。 方法： (1)在雞趾的掌面掌趾關(guān)節(jié)與近節(jié)趾間關(guān)節(jié)間行Bruner切口，游離出趾深屈肌腱(FD

3、P)，并在趾半屈曲位時(shí)用銳刀將其從掌側(cè)橫形做完全切斷，然后用5-0無(wú)創(chuàng)縫線做改良Kessler法縫合修復(fù)肌腱。在術(shù)后第3、5、7、9、14和21天分別取肌腱，做TGF-β，bFGF和IGF-1免疫組化染色，觀測(cè)其表達(dá)變化和分布。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)CTGF、TGF-β、VEGF、IGF-1、PDGF-B和bFGF基因的mRNA水平在術(shù)后第3、9、14和21天四個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)變化。 (2)用微量注射器將10微升攜帶增強(qiáng)綠色熒光蛋白

4、(EGFP)報(bào)告基因的pCMV-EGFP、pCAGGS-EGFP、AAV2-EGFP和Ad5-EGFP載體直接注射入18只雞的48根橫斷傷的趾屈肌腱近側(cè)斷端截面上取兩點(diǎn)注射。在術(shù)后第3、7、14、21天分別取肌腱，進(jìn)行冰凍切片后在熒光顯微鏡下觀察肌腱內(nèi)的EGFP表達(dá)量及分布，并將肌腱切片作HE染色后觀察各不同載體在肌腱中引起的炎癥反應(yīng)。另24根肌腱不作手術(shù)作為對(duì)照。 (3)用微量注射器將攜帶增強(qiáng)綠色熒光蛋白報(bào)告基因的pCMV-E

5、GFP、AAV2-EGFP和Ad5-EGFP注射入雞的正常趾深屈肌腱中，術(shù)后第3、7、14和21天分別取肌腱進(jìn)行冰凍切片，熒光顯微鏡觀測(cè)肌腱內(nèi)EGFP的表達(dá)。將攜帶有bFGF基因的AAV2-bFGF病毒顆粒注入完全切斷的雞的趾深屈肌腱，術(shù)后的第2、3和4周獲取注射AAV2-bFGF實(shí)驗(yàn)組的肌腱及對(duì)照組肌腱做免疫組化染色。 (4)針對(duì)雞TGFβ1基因的mRNA序列，設(shè)計(jì)并合成4對(duì)miRNA TGFβ1 DNA序列和一對(duì)不編碼序列，

6、分別插入至miRNA質(zhì)粒載體(pcDNA6．2)中，獲得5個(gè)miRNA TGFβ1質(zhì)粒載體，其分別命名為miRNA＃1、＃2、＃3、＃4和陰性對(duì)照。將不同的miRNA載體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞，用熒光顯微鏡觀測(cè)載體攜帶的增強(qiáng)綠色熒光蛋白報(bào)告基因在肌腱細(xì)胞的表達(dá)，并使用流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因的效率。采用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)并分析miRNA導(dǎo)入肌腱細(xì)胞后TGFβ1、I、III型膠原和CTGF基因表達(dá)變化。選用抑制TGFβ1表達(dá)最明顯的miRNA＃1

7、載體轉(zhuǎn)染活體損傷肌腱。在轉(zhuǎn)基因治療肌腱一周和六周后，檢測(cè)TGF-β1、I、III型膠原和CTGF基因在體內(nèi)損傷肌腱中的表達(dá)。 結(jié)果： (1)在肌腱損傷愈合早期CTGF、TGF-β基因mRNA表達(dá)水平較高，其中TGF-βmRNA在肌腱損傷后呈增高的趨勢(shì)；VEGF和IGF-1基因mRNA表達(dá)水平次之；bFGF和PDGF-B基因mRNA在肌腱損傷后表達(dá)水平較低，且bFGF基因mRNA呈逐漸下降的趨勢(shì)。TGF-β，bFGF和IG

8、F-1免疫組化也顯示相同結(jié)果。 (2)熒光顯微鏡下觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，注射4種轉(zhuǎn)基因載體的肌腱，轉(zhuǎn)染3天后即可見(jiàn)肌腱內(nèi)有增強(qiáng)綠色熒光蛋白表達(dá)；在第7天時(shí)表達(dá)最明顯；第14天時(shí)，各組表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白表達(dá)量下降；21天時(shí)很少有表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白的細(xì)胞。用微量注射器在腱段兩點(diǎn)注射能保證近損傷肌腱內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞均勻分布。注射AAV2-EGFP和Ad5-EGFP的肌腱的增強(qiáng)綠色熒光蛋白明顯多于質(zhì)粒載體的增強(qiáng)綠色熒光蛋白，而AAV2-EGFP和Ad

9、5-EGFP兩組間無(wú)明顯差異。HE染色發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒載體和Ad5-EGFP致肌腱的組織反應(yīng)較重，可見(jiàn)較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主。注射AAV2-EGFP的肌腱炎癥反應(yīng)較輕。 (3)熒光顯微鏡下可見(jiàn)三種不同的載體在肌腱內(nèi)均表達(dá)EGFP：轉(zhuǎn)染3天后即可見(jiàn)肌腱內(nèi)有EGFP表達(dá)；在第7天時(shí)表達(dá)最明顯；第14天時(shí)，各組EGFP的表達(dá)下降；21天時(shí)很少有表達(dá)EGFP細(xì)胞。在同期的時(shí)間點(diǎn)，注射AAV2-EGFP和Ad5-EGFP的肌

10、腱內(nèi)EGFP表達(dá)明顯強(qiáng)于質(zhì)粒載體，而AAV2-EGFP和Ad5-EGFP兩組之間無(wú)較大區(qū)別。術(shù)后的第2、3和4周免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)：相比于正常和對(duì)照組肌腱，注射AAV2-bFGF的肌腱表達(dá)很強(qiáng)的bFGF。 (4)體外細(xì)胞培養(yǎng)中熒光顯微鏡觀察到肌腱細(xì)胞有EGFP表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染效率為20～25％。與陰性對(duì)照細(xì)胞組相比，實(shí)時(shí)PCR結(jié)果分析顯示：miRNA＃1和＃2質(zhì)粒載體治療的細(xì)胞組TGFβ1基因表達(dá)分別下降了68％和

11、43％；在miRNA＃1治療的細(xì)胞組，III型膠原和CTGF基因表達(dá)分別也下降70％和68％，這些變化在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性。使用miRNA＃1干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因至體內(nèi)損傷肌腱結(jié)果顯示：術(shù)后一周，TGFβ1基因表達(dá)下降了67％，而I、III型膠原和CTGF基因表達(dá)沒(méi)有變化；術(shù)后六周，TGFβ1和III型膠原基因表達(dá)分別下降了56％和58％，變化在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性。 結(jié)論： (1)在肌腱損傷愈合的早期(3周內(nèi))TGF-β基因表達(dá)水

12、平較高，呈逐漸升高趨勢(shì)；CTGF，VEGF，and IGF-1表達(dá)次之；bFGF基因表達(dá)水平較低且逐漸降低；PDGF-B表達(dá)較低。 (2)用微量注射器在腱段兩點(diǎn)注射轉(zhuǎn)基因載體能轉(zhuǎn)染近損傷處的整個(gè)肌腱段的細(xì)胞。在研究的四種基因治療方法中，AAV2和Ad5在在損傷肌腱中的轉(zhuǎn)基因效率最強(qiáng)，在轉(zhuǎn)基因后第7天表達(dá)最明顯，而且AAV2引起的肌腱組織反應(yīng)最輕。提示AAV2載體比Ad5和質(zhì)粒載體有利于作為轉(zhuǎn)基因治療肌腱損傷的載體，微量注射載體是

13、轉(zhuǎn)基因至損傷肌腱的合適方法。 (3)Ad5和AAV2載體的基因轉(zhuǎn)染效率高于脂質(zhì)體-質(zhì)粒載體，AAV2攜帶的外源性bFGF基因肌腱細(xì)胞內(nèi)較強(qiáng)表達(dá)，提示我們將來(lái)在體內(nèi)轉(zhuǎn)基因到肌腱的研究中能夠選擇腺病毒和腺相關(guān)病毒載體作為運(yùn)載基因的工具。 (4)miRNA導(dǎo)入肌腱細(xì)胞后TGFβ1、III型膠原和CTGF基因表達(dá)顯著下降。導(dǎo)入miRNA至活體損傷肌腱后一周，TGFβ1基因表達(dá)顯著下降；術(shù)后六周，TGFβ1和III型膠原基因表達(dá)顯