重組人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的表達(dá)載體構(gòu)建和制備工藝研究.pdf

1、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(Insulin-like growth factor-1，IGF-1)是一廣譜促生長(zhǎng)因子，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與胰島素原類似，由70個(gè)氨基酸組成。它通過(guò)與IGF-1受體(IGF-IR)結(jié)合發(fā)揮生理作用，并受IGF結(jié)合蛋白(IGFBP)調(diào)控。
　　 基因重組人IGF-1(rhIGF-1)的臨床試驗(yàn)已經(jīng)在一系列的疾病上展開(kāi)，比較認(rèn)可的臨床適應(yīng)癥包括Laron侏儒綜合征、胰島素對(duì)抗糖尿病、腎功能不全、肌萎縮側(cè)索硬化和多發(fā)性

2、硬化癥。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)IGF-1可調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和分化，抑制多種因素導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，其抑制凋亡的機(jī)制主要涉及抗凋亡基因的激活等方面。正在進(jìn)行的臨床前研究提示其在神經(jīng)系統(tǒng)方面也會(huì)有廣闊的應(yīng)用前景。目前國(guó)外有美國(guó)Insmed公司和Tercica公司上市了rhIGF-1。產(chǎn)品均采用基因工程大腸桿菌生產(chǎn)。
　　 我國(guó)在rhIGF-1的開(kāi)發(fā)上顯然處于落后的位置，因此有必要加緊產(chǎn)品研發(fā)。本研究首先應(yīng)用基因工程技術(shù)，構(gòu)建了在新型的

3、原核表達(dá)載體，在大腸桿菌表達(dá)了該蛋白，然后我們摸索了比較理想的中試發(fā)酵工藝，并對(duì)純化方法進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究，使純化工藝適合工業(yè)化生產(chǎn)。研究?jī)?nèi)容主要包括以下三個(gè)部分：
　　 一、IGF-1表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 國(guó)內(nèi)有許多單位報(bào)道了用大腸桿菌表達(dá)IGF-1的研究，但都沒(méi)有獲得天然結(jié)構(gòu)的IGF-1。國(guó)外雖然有最終產(chǎn)物為天然結(jié)構(gòu)的IGF-1的研究報(bào)道，但純化方法繁瑣。為此我們?cè)O(shè)計(jì)了設(shè)計(jì)了新型表達(dá)載體。根據(jù)人IGF-1基因的核苷

4、酸序列設(shè)計(jì)并合成引物，以聚合酶反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增IGF-1基因；將PCR產(chǎn)物插入表達(dá)質(zhì)粒pET32的多克隆位點(diǎn)，得到的重組質(zhì)粒編碼硫氧還蛋白和人IGF-1分子的融合蛋白。我們構(gòu)建的載體在融合蛋白的連接處引入了羥胺裂解位點(diǎn)，方便后期的加工。同時(shí)載體含有6×組氨酸標(biāo)簽，簡(jiǎn)化了表達(dá)蛋白的純化步驟。以表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5α，氨芐青霉素抗性篩選，獲得序列距確的克隆。以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)，工程菌可表達(dá)分子量約28

5、 kD的重組蛋白，與目的蛋白分子量相似。重組蛋白主要以包涵體形式存在。Western blot分析證明，融合蛋白具有人IGF-1的抗原性。
　　 二、工程菌表達(dá)條件的優(yōu)化及高密度發(fā)酵工藝的初步探索
　　 作為中試工藝的初探，我們對(duì)表達(dá)重組IGF-1的E.coli DH5α工程菌的搖瓶小試發(fā)酵條件進(jìn)行研究。利用單因素法比較時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度等因素對(duì)工程菌IGF-1融合蛋白表達(dá)的影響。研究表明，對(duì)誘導(dǎo)劑IPTG，濃度可降低到0

6、.125mM仍可獲得較好的表達(dá)效果；3種培養(yǎng)基中LB的產(chǎn)率略高；最佳誘導(dǎo)時(shí)間為5小時(shí)。優(yōu)化后的表達(dá)條件可以明顯減少誘導(dǎo)劑IPTG的用量。
　　 為了新藥臨床前研究打下基礎(chǔ)，我們?cè)趽u瓶小試發(fā)酵的基礎(chǔ)上進(jìn)行中試規(guī)模的發(fā)酵研究。在5升的發(fā)酵灌上對(duì)高密度發(fā)酵的參數(shù)進(jìn)行初步的探索結(jié)果表明，在添加微量元素后菌體的密度可以提高1倍。在30-60％的氧溶下工程菌的密度進(jìn)一步提高了4倍，明顯提高了發(fā)酵效率。由于IPTG價(jià)格昂貴，且有一定的毒性，我

7、們還對(duì)乳糖的誘導(dǎo)效果進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)0.2％乳糖也可達(dá)到很好的誘導(dǎo)效果，從而可以替代IPTG。因此我們建立的中試發(fā)酵條件具有較高的效率。
　　 三、rhIGF-1的純化工藝和對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用研究
　　 建立一個(gè)方便、價(jià)廉的純化方法是開(kāi)發(fā)基因工程蛋白產(chǎn)品的關(guān)鍵之一。文獻(xiàn)報(bào)道采用IgG為親和介質(zhì)的純化方法雖然特異性高，但價(jià)格高。鑒此我們?cè)跇?gòu)建表達(dá)載體時(shí)引入了6×組氨酸純化標(biāo)簽，對(duì)融合蛋白采用金屬親和層析法進(jìn)行純化。純化的

8、融合蛋白經(jīng)羥胺裂解后再次進(jìn)行金屬親和層析法純化。結(jié)果表明采用該工藝可以得到高純度的融合蛋白和目的蛋白。釋放的蛋白經(jīng)飛行質(zhì)譜鑒定，蛋白質(zhì)分子量符合理論值。對(duì)純化的蛋白進(jìn)行復(fù)性后采用MTT法測(cè)定其對(duì)神經(jīng)瘤母細(xì)胞瘤細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果表明，純化的蛋白可以抑制岡田酸對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的毒性。該結(jié)果支持了IGF-1用于阿爾茲海默病治療的設(shè)想。
　　 為了使制備工藝更適合工業(yè)化生產(chǎn)，我們采用國(guó)產(chǎn)Co-NTA色譜填料對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果和

9、進(jìn)口Ni-NTA色譜填料相似，而價(jià)格只有后者的十分之一。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)蔗糖滲透壓休克處理可以提高純化的效率。因此我們建立的純化工藝非常適合工業(yè)化生產(chǎn)。
　　 綜上所述，本研究表明我們建立的人IGF-1原核表達(dá)載體能高效表達(dá)融合蛋白，獲得的目的蛋白具有很好的活性。采用乳糖誘導(dǎo)避免了傳統(tǒng)的IPTG誘導(dǎo)劑的毒性并減少了成本。此外采用羥胺裂解的思路建立的IGF-1表達(dá)載體非常適合工業(yè)化生產(chǎn)。在下游的純化工藝中證明國(guó)產(chǎn)Co-NTA色譜填