牽張力對椎間盤細(xì)胞基質(zhì)蛋白的影響及相關(guān)基因芯片研究.pdf

1、[研究背景]腰椎間盤退變是引起臨床上各種下腰痛、腰椎間盤突出及腰椎管狹窄的常見病理生理過程。研究表明，搬運重物的體力勞動者、長時間坐位工作者在病理學(xué)上椎間盤退行性改變顯著；從事機床、卡車司機及搬運重物的職業(yè)是下腰痛及椎間盤突出的危險因素，患椎間盤突出癥的幾率是一般成人的3倍。由此可見力學(xué)因素在腰椎間盤退行性變的發(fā)展中起非常重要的作用。在生物化學(xué)水平上，椎間盤退變首先表現(xiàn)為髓核基質(zhì)蛋白改變，糖胺聚糖減少、Ⅰ型膠原蛋白（Collagen-Ⅰ

2、）和Ⅱ型膠原蛋白（Collagen-Ⅱ）比例變化，伴基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）合成及活性增加，纖維環(huán)則主要表現(xiàn)為基質(zhì)蛋白中膠原組分和構(gòu)成的變化。因此，研究力學(xué)因素對基質(zhì)蛋白的影響對于深入理解椎間盤退變的過程有重要意義，可為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 [目的]（1）深入研究牽張力對人椎間盤細(xì)胞基質(zhì)蛋白及其代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響，以及力學(xué)作用后相關(guān)基因的時間動力學(xué)變化，探討牽張力在腰椎間盤退變過程中的作用；（2）建立基因芯片，研究

3、牽張力作用于椎間盤細(xì)胞后其余基因的變化，尋找其中變化顯著者，為進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)、指明方向。[材料與方法]取人腰椎間盤組織體外培養(yǎng)纖維環(huán)細(xì)胞及髓核細(xì)胞。（1）驗證纖維環(huán)細(xì)胞及髓核細(xì)胞的表型；（2）將纖維環(huán)細(xì)胞及髓核細(xì)胞種植于彈力膜上，分別施加2％、5％、10％形變量的牽張力1小時，24小時后用Real-time RT-PCR檢測基質(zhì)蛋白Aggrecan和Collagen-Ⅱ、基質(zhì)降解酶MMP-3及其抑制劑TIMP-1的mRNA表達(dá)變

4、化；（3）10％形變量的牽張力作用于纖維環(huán)細(xì)胞后，用Affymetrix公司提供的GeneChip3’IVT Express Kit行基因芯片實驗，檢測纖維環(huán)細(xì)胞中各基因表達(dá)變化；（4）以10％形變量的牽張力作用于髓核細(xì)胞1小時，此后分別于0、12、24、48小時收取細(xì)胞，檢測Aggrecan、Collagen-Ⅱ、MMP-3、TIMP-1 mRNA表達(dá)變化及其時間動力學(xué)特點。[結(jié)果]（1）纖維環(huán)細(xì)胞及髓核細(xì)胞呈多角形單層生長，Ⅱ型膠原

5、表達(dá)陽性；（2）纖維環(huán)細(xì)胞中，5％及10％形變量牽張力對AggrecanmRNA表達(dá)無顯著影響，但可明顯促進(jìn)Collagen-Ⅱ、MMP-3及TIMP-1 mRNA表達(dá)（P<0.05），以TIMP-1升高為著；2％牽張力對上述基因表達(dá)均無顯著影響；（3）10％形變量的牽張力作用1小時后，纖維環(huán)細(xì)胞中mRNA表達(dá)出現(xiàn)2倍以上變化的基因有1600多個，5倍以上變化的基因有119個。mRNA水平升高最為顯著的四個基因是SERPINA1、IL-

6、8、PRG4和TNFAIP6，分別為對照33.8倍、27.1倍、26.9倍和25.3倍；下降最為顯著的基因是KRT19，其表達(dá)降至對照的0.04。（4）髓核細(xì)胞中，5％和10％形變量的牽張力均可顯著抑制Aggrecan mRNA表達(dá)，促進(jìn)MMP-3及TIMP-1 mRNA表達(dá)（P<0.05），以MMP-3升高為著。5％牽張力促進(jìn)Collagen-Ⅱ mRNA表達(dá)，10％牽張力則表現(xiàn)為抑制作用（P<0.05）。（5）10％牽張力作用后，髓

7、核細(xì)胞不同基因mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)一定時序性：Aggrecan和Collagen-Ⅱ mRNA分別于作用后12h、0h降至最低值，MMP-3和TIMP-1 mRNA分別于作用后0h、24h達(dá)峰。[結(jié)論]（1）牽張力對椎間盤細(xì)胞基質(zhì)蛋白的影響與牽張力強度有關(guān)：低強度（2％形變量）牽張力對纖維環(huán)細(xì)胞基質(zhì)蛋白表達(dá)無顯著影響；中等強度（5％形變量）和較高強度（10％形變量）牽張力在纖維環(huán)細(xì)胞中傾向于引起基質(zhì)重塑，而在髓核細(xì)胞中則表現(xiàn)為基質(zhì)破壞為主

8、的過程，且在較高強度牽張力時該作用更為顯著。髓核細(xì)胞對牽張力的耐受閾值可能較纖維環(huán)細(xì)胞低。（2）較高強度牽張力作用后髓核細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)中不同基因mRNA表達(dá)有一定時序性，反映了基質(zhì)急性損傷和修復(fù)、重塑的過程。力學(xué)刺激強度、持續(xù)時間以及作用時間間隔可能決定了髓核細(xì)胞是否朝退變方向發(fā)展。（3）除了己知MMPs、TIMPs參與維持基質(zhì)穩(wěn)定的過程，SERPINA1、GRP4等基因也可能在椎間盤基質(zhì)代謝中扮演重要角色。關(guān)于力學(xué)因素對椎間盤SERP