基因芯片定量PCR的研究.pdf

1、熒光定量PCR是近年來新發(fā)展起來的PCR新技術(shù),為基因定量分析的發(fā)展起到了巨大的推動作用。現(xiàn)有的熒光定量PCR技術(shù)主要基于熒光能量傳遞技術(shù)[1](fluoresce nceresonance energy transfer, FRET)而發(fā)展起來的,該技術(shù)可以通過增加不同范圍波長的熒光基團來實現(xiàn)多種靶基因序列的定量分析。但因可使用的標(biāo)記的熒光基團的激發(fā)波長帶寬與檢測波長帶寬范圍的限制,目前最多可同時檢測的靶基因序列不多,無法實現(xiàn)真正意義

2、上的高通量檢測。針對這一現(xiàn)狀,本實驗研究小組在基因芯片的基礎(chǔ)上發(fā)展了TaqMan微陣列芯片檢測技術(shù)[2],該技術(shù)不受檢測波長等的限制,初步實現(xiàn)了基因的多位點定量分析。本論文以該芯片定量分析技術(shù)為基礎(chǔ),進(jìn)一步發(fā)展建立了基于通用熒光探針的微陣列定量PCR分析技術(shù),為生物分子的定量分析檢測平臺的建立打下了基礎(chǔ)。 本論文的主要研究內(nèi)容有： 1. 通用熒光探針體系的建立。通過多重在片PCR體系中特異引物和通用熒光探針(引物)比例及

3、濃度的優(yōu)化,發(fā)展建立了單熒光基團標(biāo)記通用探針的多重在片PCR擴增體系。該通用探針定量體系大大降低了實驗成本,拓寬了該定量技術(shù)的應(yīng)用范圍。 2. 熒光衰減與初始模板量數(shù)學(xué)關(guān)系的建立。在熒光定量分析中,初始靶標(biāo)的濃度往往與熒光強度呈正相關(guān)。本實驗研究中采用了基于能量傳遞的單熒光基團標(biāo)記技術(shù),根據(jù)PCR動力學(xué)原理,推導(dǎo)出熒光衰減率(熒光信號減弱的絕對值與芯片背景值的比率)與初始模板最存在線性關(guān)系,利用標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行的多重在PCR擴增亦獲

4、得一致結(jié)果,故熒光強度的衰減也可用于定量分析。 3. 全封閉的通用定量檢測體系的建立。通過對包含有五對標(biāo)準(zhǔn)模板的多樣本多引物在片PCR體系的擴增優(yōu)化,采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行PCR定量分析,繪制出定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。實驗讓實,該方案避免了現(xiàn)有定量PCR外標(biāo)法管間的差異,減小實驗誤差,提高實驗檢測的可靠性。通過實驗研究,本研究進(jìn)一步讓實了基因芯片定量PCR分析方法的可行性,并確立了在該技術(shù)中的通用探針和定量方案；通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,得到了一組可進(jìn)