肺腺癌A549細胞放射生物學效應及線粒體DNA基因差異表達研究.pdf

1、目的:放射治療目前仍為肺腺癌治療的主要手段之一。DNA是輻射誘導增殖細胞死亡的主要靶點，線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)作為惟一的核外遺傳物質，其編碼基因參與細胞氧化磷酸化(oxidativephosphorization，OXPHOS)和能量代謝，與細胞的存亡息息相關。因此，探討肺腺癌細胞放射生物學效應與其mtDNA基因表達變化的相關性，可為進一步闡明肺腺癌放射治療機制提供實驗依據。 方法:以人肺腺

2、癌A549細胞系為研究對象，未予射線照射的同步培養(yǎng)細胞為對照，設計兩組實驗：(1)8MVX線分別以2Gy、4Gy、6Gy、8Gy的吸收劑量照射A549細胞，照射后培養(yǎng)24h；(2)8MVX線以4Gy吸收劑量照射A549細胞，照射后分別培養(yǎng)12h、24h、48h、72h。MTT法測定細胞增殖狀態(tài)，繪制不同劑量照射后細胞的增殖曲線；以流式細胞技術檢測照射后不同劑量點及時間點的細胞周期分布變化及凋亡率；電鏡下觀察照射前后細胞形態(tài)變化；提取對照

3、組、照射后不同劑量點及時間點的A549細胞總RNA，逆轉錄熒光標記，用人mtDNA基因表達譜芯片平行檢測26個靶基因的差異表達，GenPixPro芯片圖像分析軟件進行基因差異的統(tǒng)計學分析。 結果:8MVX線不同劑量照射后A549細胞均出現增殖抑制，4Gy照射后抑制較顯著。 透射電鏡觀察顯示，X線照射后部分A549細胞可見凋亡的形態(tài)學特征，如細胞體積變小，染色質濃集致密、邊集或碎裂成不規(guī)則塊狀，細胞質密度升高，胞漿空泡化，

4、核膜完整等。 2Gy、4Gy、6Gy、8GyX線照射后培養(yǎng)24h，A549細胞普遍表現為S期細胞百分率下降，而且隨著劑量的增加，凋亡率增加，6Gy和8Gy劑量組表現G2/M期阻滯，4Gy為G2/M期阻滯增加并伴隨凋亡率增加的劑量效應拐點；4GyX線照射后培養(yǎng)12h即可觀察到G2/M期的阻滯，在12h～24h阻滯“崩潰”，細胞被“釋放”，再度進入細胞周期，培養(yǎng)72h的細胞周期分布基本接近未照射組，在照射早期隨培養(yǎng)時間延長凋亡率表現

5、為增長趨勢，48h為最高，達到10.14％。 不同劑量X線照射后A549細胞的mtDNA基因差異表達：2GyX線照射后培養(yǎng)24h，mtDNAtRNA-ASP、tRNA-HIS、tRNA-GLU基因表達顯著下調；4GyX線照射后培養(yǎng)24h，mtDNAtRNA-HIS、tRNA-GLU、ND1、ND2、ND3、ATPase6基因表達顯著下調；6GyX線照射后培養(yǎng)24h，mtDNAtRNA-GLU、tRNA-HIS、tRNA-ASN、

6、tRNA-CYS、tRNA-ALA、tRNA-SER及16SrRNA基因表達顯著下調；8GyX線照射后培養(yǎng)24h，mtDNAtRNA-HIS、tRNA-GLU基因表達顯著下調。 4GyX線照射A549細胞后不同時間mtDNA基因的差異表達：照射后培養(yǎng)12h，mtDNAtRNA-HIS、ND1、ND2、ND4L及ND5基因表達顯著下調；照射后培養(yǎng)24h，mtDNA16SrRNA、ND1、ND2、ND4、ND4L、COXⅠ、COXⅡ

7、、COXⅢ、ATPase6及ATPase8基因表達顯著下調；照射后培養(yǎng)48h，mtDNA編碼的13個多肽基因，2個rRNA基因，tRNA-ALA、tRNA-ASP、tRNA-ARG、tRNA-HIS基因表達均顯著下調；照射后培養(yǎng)72h，mtDNA編碼的11個多肽基因(COXⅠ及Cytb基因除外)，2個rRNA基因表達顯著下調。 結論:不同劑量X線照射A549細胞的早期(12h～48h)，主要誘導G2/M期阻滯，隨后阻滯逐步解除，