二氧化鈰納米顆粒對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響.pdf

1、1、研究背景和目的：
　　目前，隨著我國經(jīng)濟發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，缺血性心臟疾病的發(fā)生率和由此引發(fā)的死亡率正不斷上升。各種臨床治療手段的不斷更新發(fā)展，為此類疾病提供了更多更有效的治療方法，但同時心肌缺血再灌注損傷(Myocardium ischemic reperfusion injury，MIRI)在患者病情的恢復中起到的不利影響也逐漸突顯了出來。心肌缺血再灌注損傷表現(xiàn)為當心肌細胞經(jīng)過一段時間的缺血期，血流供應恢復之后，

2、心肌細胞的損傷并沒有減輕或者恢復，反而出現(xiàn)了較再灌注以前更加嚴重的損傷的現(xiàn)象。如何有效的防治缺血再灌注損傷對心肌細胞造成的損害成為有關醫(yī)學研究的一個熱點，相關的研究有如β-受體阻滯劑，鈣離子拮抗劑，腎素血管緊張素抑制劑等，但效果卻都不是十分的理想。因此，尋找到一種切實而有效的方法或藥物來治療或者改善缺血再灌注損傷成為臨床上一個亟待解決的問題。
　　心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生機制十分復雜。細胞凋亡被認為是其重要的發(fā)生機制之一。凋亡又稱

3、為細胞的程序性死亡，再灌注后心肌梗死面積擴大即認為是細胞凋亡引起的。缺血再灌注過程中的細胞凋亡可能是由氧自由基(oxygen free radicals，OFR)的大規(guī)模爆發(fā)性產(chǎn)生、細胞內的鈣超載、線粒體損傷等幾個原因引起的，其中氧自由基的大量產(chǎn)生被認為是最主要的原因之一。在心肌的缺血再灌注過程中，氧自由基起到了至關重要的作用。心肌缺血再灌注后出現(xiàn)的心律失常、心肌梗死面積擴大等現(xiàn)象均是由于大量爆發(fā)性產(chǎn)生的氧自由基引起的。缺血再灌注過程中

4、，大量產(chǎn)生的氧自由基對細胞結構進行了破壞，其與細胞膜磷脂中含量較多的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化反應，使細胞膜上的離子通道、酶等膜蛋白的活性降低，從而影響了細胞膜及細胞器膜的功能，使其完整性遭到破壞，流動性降低。
　　我國的稀土資源豐富，二氧化鈰作為一種稀土材料被廣泛的應用于各個領域。納米材料因其自身尺度的原因而具有特殊的物理化學性質，針對納米材料的研究也日漸深入。二氧化鈰納米顆粒(CeO2 nanoparticles)作為一種納米

5、材料，在近些年來被應用于工業(yè)、汽車制造業(yè)及人民日常生活中的多個方面。有研究證實，二氧化鈰納米顆粒具有能夠清除氧自由基，減弱有機體的氧化應激反應等很強的生物活性。
　　本研究旨在觀察二氧化鈰納米顆粒對大鼠缺血再灌注損傷心肌組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和細胞凋亡

6、(apoptosis)的影響，從而探討其對大鼠缺血再灌注損傷心肌的保護作用，為對缺血再灌注損傷提供更多的防治手段。
　　2、材料和方法：
　　2.1、二氧化鈰納米顆粒懸液的制備:分別將不同納米粒徑的二氧化鈰納米顆粒溶解在PBS緩沖液(PH7.4，0.01mM)中，并使其充分混勻，注射前，再將其放入超聲細胞破碎儀中，進行超聲震蕩2min的操作，使懸液再次充分混合均勻，完成后再用0.2μm的針頭過濾器過濾方可使用。
　　2

7、.2、實驗動物分組:健康雄性SD大鼠50只，體重在250～300g之間，隨機分成5組，假手術(sham)組、模型(I/R)組、1-10nm粒徑組、10-25nm粒徑組、50nm粒徑組，每組10只。適應性飼養(yǎng)一周后進行模型的制作。大鼠采用10％水合氯醛(300mg/kg)進行腹腔注射麻醉，仰臥位固定牢固，分離氣管行氣管插管，開胸時連接呼吸機。小動物呼吸機潮氣量設定為3ml/100g，呼吸頻率為70次/分，呼吸比2∶1。在大鼠胸骨左緣心臟搏

8、動最為明顯處切開皮膚，自第4、5肋間進胸，撕破心包膜，充分暴露心臟。于肺動脈圓錐與左心耳之間距離主動脈根部約3～4mm處穿線，在結扎線和心臟表面墊一帶有凹槽的乳膠管，待心律規(guī)整后結扎左冠狀動脈前降支（left anterior decreased coronary artery，LAD），結扎線遠端心肌顏色先變白后變?yōu)樽辖C證明結扎成功。結扎45min后松解結扎線，再灌注120min，缺血部位心肌顏色恢復為模型制作成功。假手術組于術前24

9、h尾靜脈注射PBS緩沖液(0.2ml/100g)，左冠狀動脈前降支只穿線不結扎;模型組于術前24h經(jīng)尾靜脈注射PBS緩沖液(0.2ml/100g)，左冠狀動脈前降支結扎45min，松解120min，成功制作缺血再灌注模型;三種不同納米粒徑組均于術前24h經(jīng)尾靜脈注射各自粒徑Ce02納米懸液(0.2ml/100g)，模型制作同模型組。
　　2.3、心肌再灌注120min后處死大鼠，迅速取出心臟，冷生理鹽水充分沖洗至無血液殘留，取左心

10、室缺血區(qū)心肌組織，分為兩部分，一部分迅速用濾紙吸干水分后轉移至-80℃冰箱中保存待用，另外一部分置于甲醛溶液中固定，用于組織病理學觀察和細胞凋亡的檢測。將-80℃冰箱中保存的新鮮心肌組織在低溫環(huán)境下制備心肌組織勻漿，應用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，比色法測定GSH-Px活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量。具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。將甲醛溶液中固定的部分大鼠心肌組織制備常規(guī)石蠟切片，用于蘇木素-伊紅染色（HE染色）、細胞凋亡

11、的檢測。
　　2.4、統(tǒng)計各組數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，各組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，應用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行分析，檢驗水準α取0.05，P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。
　　3、結果：
　　3.1、模型組大鼠心肌組織中SOD、GSH-Px活性比假手術組明顯降低，組間差異顯著(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義;三組不同粒徑二氧化鈰納米組心肌組織中SOD、GS

12、H-Px活性比模型組明顯升高(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義;三組不同粒徑二氧化鈰納米顆粒組之間相比，10-25nm粒徑組SOD、GSH-Px活性明顯高于另外兩組(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義，1-10nm粒徑組與50nm粒徑組比較，SOD、GSH-Px活性明顯升高(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　3.2、模型組大鼠心肌組織中MDA含量比假手術組明顯升高（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學意義;三組不同粒徑二氧化鈰

13、納米顆粒組心肌組織中MDA含量比模型組明顯降低(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義;三組不同粒徑二氧化鈰納米顆粒組之間相比，10-25nm粒徑組MDA含量明顯低于另外兩組(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義，1-10nm粒徑組與50nm粒徑組比較，MDA含量明顯降低(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　3.3、大鼠心肌組織病理學顯示，假手術組較模型組心肌細胞結構完整，三種不同粒徑二氧化鈰納米顆粒組和模型組比較細胞形態(tài)有明顯的

14、改善，但仍然不如假手術組，存在炎癥細胞浸潤等現(xiàn)象。
　　3.4、心肌細胞凋亡檢測結果顯示，模型組心肌細胞凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)較假手術組顯著升高(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義;三種不同粒徑二氧化鈰納米顆粒組AI均明顯低于模型組(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義，其中10-25nm組AI明顯低于另外兩組(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義，1-10nm組、50nm組兩組之間無顯著差異(P＞0.05)