地五養(yǎng)肝膠囊對四氯化碳誘導MSG-大鼠肝纖維化及EMT-MET失衡機制的影響.pdf

1、目的：通過觀察體現(xiàn)“補腎生髓成肝”治療法則的“地五養(yǎng)肝膠囊”對四氯化碳（CCL4）誘導的MSG-大鼠肝纖維化模型的影響及機制，研究“地五養(yǎng)肝膠囊”調(diào)控EMT/MET失衡的作用機制，揭示EMT/MET失衡所致的“髓失生肝”病因病機和“補腎生髓成肝”調(diào)控肝再生和EMT/MET失衡的科學內(nèi)涵，為肝纖維化的臨床治療提供新的治療思路和方向。
　　方法：Wistar大鼠新生乳鼠，于出生第2、4、6、8、10天時皮下注射左旋谷氨酸單鈉（MSG）

2、-生理鹽水溶液，劑量為每次4mg/g體重。28天離乳后，6周齡時分籠飼養(yǎng)，選取注射MSG-生理鹽水溶液的雄性大鼠18只隨機分為3組(每組6只):①MSG-大鼠空白對照組（以下簡稱對照組）,②四氯化碳誘導 MSG-大鼠肝纖維化“地五養(yǎng)肝膠囊”治療組（以下簡稱治療組）,③四氯化碳誘導MSG-大鼠肝纖維化模型組（以下簡稱CCL4-MSG-模型組）。再隨機選取6只Wistar正常雄性大鼠為模型對照組，即④四氯化碳誘導正常大鼠肝纖維化模型組（以下

3、簡稱CCL4-模型組），故實驗共分為4組。對照組大鼠給予大豆油皮下注射6周，2次/周，劑量為1mL/kg；治療組、CCL4-MSG-模型組、CCL4-模型組大鼠給予50％ CCl4/大豆油溶液皮下注射6周，2次/周，劑量為1mL/kg。在造模同時，治療組大鼠給予地五養(yǎng)肝膠囊-生理鹽水溶液灌胃6周，1次/日，劑量為360 mg/kg；而對照組、CCL4-MSG-模型組、CCL4-模型組大鼠給予等體積的生理鹽水灌胃6周。6周后處死全部大鼠，

4、分別取4組大鼠腦組織下丘腦部分做蘇木素-伊紅(HE)染色，以觀察MSG-大鼠造模情況。分別取4組大鼠肝組織進行特殊染色處理：肝組織蘇木素-伊紅(HE)染色和Masson染色，以觀察肝臟損傷程度和肝組織膠原纖維含量。用實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)和蛋白免疫印跡法(Western-blotting)觀察MSG-大鼠肝組織E-鈣粘蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)，轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）和骨形成蛋白7（BM

5、P-7）以及與EMT/MET失衡相關(guān)的Hedgehog信號通路標志物信號激活配體SHH、信號傳遞跨膜受體PTC和SMO、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Gli-1的mRNA和蛋白表達。實時熒光定量RT-PCR法所得Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，對照組為標準值“1”，用2-△△Ct計算法計算。Western-blotting法所拍的圖像用Gel-pro analyzer軟件進行處理，選定分析區(qū)域，獲取平均積分光密度值(I0D)。所有數(shù)據(jù)均利用統(tǒng)計軟件SPSS1

6、7.0中文版處理，結(jié)果以Mean±SD表示。進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）來統(tǒng)計分析，p﹤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果繪制圖表。
　　結(jié)果：下丘腦組織病理切片（HE染色）結(jié)果顯示，MSG-大鼠下丘腦弓狀核神經(jīng)元細胞發(fā)育明顯異常，MSG-大鼠下丘腦神經(jīng)元受損。肝組織病理切片（HE染色）結(jié)果顯示：對照組肝臟組織結(jié)構(gòu)基本正常；治療組、CCL4-模型組和CCL4-MSG-模型組均出現(xiàn)肝細胞脂肪變性和氣球樣變

7、，以及肝纖維化結(jié)締組織增生；但是“地五養(yǎng)肝膠囊”治療組比 CCL4-MSG-模型組的MSG-大鼠肝細胞損傷減輕，肝纖維化程度降低；CCL4-MSG-模型組比CCL4-模型組肝細胞損傷更多、更明顯，肝纖維化程度更重。肝組織膠原纖維含量測定（Masson染色）結(jié)果，即是肝纖維化程度結(jié)果顯示：CCL4-MSG-模型組（16.23±9.76）與對照組（0.04±0.05）相比，肝纖維化組織增生顯著增多；CCL4-MSG-模型組（16.23±9.

8、76）與CCL4-模型組（10.10±1.92）相比，肝纖維化程度更重；治療組（2.54±1.71）與CCL4-MSG-模型組（16.23±9.76）相比，肝纖維化組織增生明顯減少；以上結(jié)果均具有統(tǒng)計學意義。
　　實時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示：① CCL4-MSG-模型組比對照組上皮細胞標志物E-cadherin（0.75±0.42）表達減少、間質(zhì)細胞標志物Vimentin（7.33±5.11）表達增高，表明CCL4誘導的MS

9、G大鼠在肝纖維化過程中發(fā)生了EMT。經(jīng)“地五養(yǎng)肝膠囊”治療后，治療組與CCL4-MSG-模型組相比，治療組（1.48±1.21）大鼠肝組織的E-cadherin的mRNA含量的表達明顯高于CCL4-MSG-模型組（0.75±0.42），治療組（0.95±0.64）大鼠肝組織Vimentin的mRNA含量的表達明顯低于MSG-CCL4-模型組（7.33±5.11），以上結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學處理，差異顯著，p<0.05。②四氯化碳誘導MSG大鼠肝纖

10、維化組織中發(fā)現(xiàn) CCL4-MSG-模型組TGF-β1 mRNA含量（6.01±5.92）高于對照組，而BMP-7 mRNA含量（0.63±0.24）低于對照組；“地五養(yǎng)肝膠囊”治療組大鼠肝纖維化組織中發(fā)現(xiàn)TGF-β1（1.17±0.69） mRNA含量的表達水平比CCL4-MSG-模型組（6.01±5.92）下降，而BMP-7（1.24±0.76）mRNA含量比CCL4-MSG-模型組（0.63±0.24）的表達上升；TGF-β1/BM

11、P-7的比值治療組（1.04±0.76）較CCL4-MSG-模型組（9.75±4.78）明顯下降，以上結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學處理，差異顯著，p<0.05。③對照組大鼠肝組織中Hedgehog信號通路處于靜默狀態(tài)，而CCL4-MSG-模型組大鼠肝組織中Hedgehog信號通路處于激活狀態(tài)，故Hedgehog信號通路相關(guān)標志物mRNA的表達CCL4-MSG-模型組均高于對照組；而經(jīng)“地五養(yǎng)肝膠囊”治療后的治療組Hedgehog信號通路處于受抑制狀態(tài)，

12、故激活配體SHH治療組（1.46±0.92）較CCL4-MSG-模型組（4.12±3.28）、膜受體PTC治療組（0.96±0.38）較CCL4-MSG-模型組（2.21±1.10）和膜上聯(lián)合受體SMO治療組（1.66±1.30）較CCL4-MSG-模型組（4.90±3.52）、核轉(zhuǎn)錄因子Gli1治療組（3.35±2.75）較CCL4-MSG-模型組（8.46±9.72）的mRNA含量表達均顯著減少，以上結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學處理，差異明顯，p<

13、0.05。
　　Western blotting結(jié)果顯示：①CCL4-MSG-模型組與對照組相比，CCL4-MSG-模型組(0.79±0.34)的上皮細胞標志物 E-cadherin蛋白表達明顯低于對照組(4.51±2.27)，CCL4-MSG-模型組（1.68±0.61）間皮細胞標志物Vimentin蛋白的表達高于對照組（0.20±0.13）。經(jīng)“地五養(yǎng)肝膠囊”治療后，治療組與CCL4-MSG-模型組相比，治療組（3.76±3.

14、61）的E-cadherin蛋白的表達高于 CCL4-MSG-模型組(0.79±0.34)，而Vimentin蛋白的表達治療組（0.99±0.29）低于 CCL4-MSG-模型組（1.68±0.61），以上結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學處理，差異顯著，p﹤0.05。表明經(jīng)“地五養(yǎng)肝膠囊”治療后大鼠肝纖維化過程中的EMT受到一定程度的抑制，促進了MET的發(fā)生，從而減輕了肝纖維化的病情進展；②大鼠肝纖維化組織中TGF-β1蛋白的表達，CCL4-MSG-模型組

15、（1.98±1.15）較對照組（0.13±0.07）明顯升高，經(jīng)治療后治療組（0.46±0.08）較CCL4-MSG-模型組（1.98±1.15）明顯下降；但是BMP-7蛋白的表達則是CCL4-MSG-模型組（0.56±0.18）較對照組（2.15±0.53）明顯降低，而治療組（3.30±0.57）較CCL4-MSG-模型組（0.56±0.18）明顯升高，故TGF-β1/BMP-7的比值治療組（0.81±0.33）比CCL4-MSG-模

16、型組（6.31±1.17）顯著減少，以上結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學處理，差異顯著，p﹤0.05；③對照組中Hedgehog信號通路未激活其相關(guān)標志物的蛋白表達量都很低，而在CCL4-MSG-模型組中由于 Hedgehog信號通路的激活相關(guān)標志物的蛋白表達量都顯著升高，如通路激活所需配體SHH CCL4-MSG-模型組（2.68±1.15）較對照組（0.29±0.15），膜受體PTC CCL4-MSG-模型組（5.11±1.79）較對照組（0.27±0

17、.10）和膜上聯(lián)合受體SMO CCL4-MSG-模型組（3.66±1.67）較對照組（0.25±0.13），核轉(zhuǎn)錄因子Gli-1 CCL4-MSG-模型組（1.50±0.37）較對照組（0.29±0.06）均顯著升高；經(jīng)“地五養(yǎng)肝膠囊”治療的治療組MSG大鼠肝組織中Hedgehog信號通路明顯受抑制其相關(guān)標志物的蛋白表達量都顯著降低，如通路激活所需配體 SHH治療組（1.37±0.20）較CCL4-MSG-模型組（2.68±1.15），

18、膜受體PTC治療組（2.04±0.85）較CCL4-MSG-模型組（5.11±1.79）和膜上聯(lián)合受體SMO治療組（1.06±0.36）較CCL4-MSG-模型組（3.66±1.67），核轉(zhuǎn)錄因子Gli1治療組（0.77±0.30）較CCL4-MSG-模型組（1.50±0.37）均顯著減少，以上結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學處理，差異顯著，p<0.05。
　　結(jié)論:四氯化碳誘導 MSG大鼠肝纖維化模型組比四氯化碳誘導正常大鼠肝纖維化模型組的大鼠肝纖

19、維化程度更重。CCL4誘導的MSG大鼠肝纖維化存在EMT/MET失衡的“髓失生肝”的病因病機，其肝組織上皮細胞標志物表達水平下調(diào)，而間質(zhì)細胞標志物表達水平上調(diào)?！暗匚屦B(yǎng)肝膠囊”能延緩或減輕肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，通過調(diào)節(jié)EMT/MET失衡(抑制EMT而促進MET)從而改善“髓失生肝”。并且在CCL4誘導的MSG大鼠肝纖維化中發(fā)現(xiàn)Hedgehog信號通路處于激活狀態(tài)，TGF-β1的表達明顯增高，而BMP-7的表達明顯減少，實驗結(jié)果表明“地五養(yǎng)