彌漫性大B細胞淋巴瘤bcl-2、bcl-6基因所在染色體區(qū)域異常的檢測及意義.pdf

1、目的 一、探究采用免疫組化方法對DLBCL進行分子亞分類對臨床診療有無指導意義。 二、建立石蠟包埋組織進行FISH檢測的一套方法，并探究使用該方法進行FISH檢測DLBCLt(14；18)(q32；q21)染色體易位、擴增及3q27斷裂、擴增的可行性。 三、明確DLBCLbcl-2基因t(14；18)(q32；q21)染色體易位及bcl-2基因染色體擴增與蛋白表達、分子分類及臨床因素的關系。 四、明確DL

2、BCLbcl-6基因相關的3q27斷裂及擴增情況，闡明其與分子分類及臨床預后的相關性，研究其對指導DLBCL的臨床分類及治療的意義。 方法 一.研究對象 收集南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院病理科、廣州市第一人民醫(yī)院病理科、廣東省武警總隊醫(yī)院病理科、廣州市金域醫(yī)學檢驗中心1999-2005年外檢中診斷為DLBCL的標本，切片經HE染色、免疫組化染色，重新閱片，診斷標準按照WHO“造血和淋巴組織腫瘤性疾病”新分類(2001

3、)，確定60例為DLBCL。60例DLBCL中，經過正規(guī)CHOP方案治療的病例有36例，歸為一組，用于分析臨床療效及各因素之間的關系。在實驗方法學的研究中所需的其它組織標本均取自南方醫(yī)院病理科。 二.DLBCL的亞分類 采用Hans等人創(chuàng)建的利用免疫組化方法對DLBCL進行亞分類，選用CD10、BCL-6和MUM1三種抗體。其中CD10、BCL-6作為生發(fā)中心細胞的標記物，CD10+或CD10+/BCL-6+，為GCB類

4、；CD10-/BCL-6-，為non-GCB類；MUM1表達于B細胞發(fā)育后期，作為后生發(fā)中心來源的標志物，若CD10-/BCL-6+，則用MUM1來分類：MUM1+為non-GCB類，MUM1-為GCB類。 采用了組織微陣列技術(TMA)進行免疫組化染色，同時還檢測了bcl-2基因在DLBCL中的表達情況。 三.PCR檢測t(14；18)(q32；q21)染色體異位 本文采用PCR及FISH兩種方法檢測DLBCL

5、的t(14；18)(q32；q21)染色體異位。t(14；18)(q32；q21)染色體異位其主要斷裂區(qū)(MBR)約占60％～70％，基因的斷裂點則相對恒定，主要在J區(qū)，正因為MBR的斷裂點比較恒定，因此可以采用PCR法對其進行檢測，對檢測陽性的產物通過TA克隆及測序進行驗證。 為了提高檢測的特異度，我們還設計了用半巢式PCR對t(14；18)(q32；q21)進行檢測的方法。即利用專業(yè)的引物設計軟件Primerpremier在

6、原有的檢測t(14；18)(q32；q21)MBR引物的下游設計了第二重引物，與原下游引物構成半巢式PCR反應的第二對引物，來提高檢測的準確性，并通過測DNA序進行證實。 四.細胞及細胞核陣列的制作及應用 在進行DLBCL的FISH實驗時，我們嘗試著對石蠟包埋的組織進行較厚的切片，經脫蠟及蛋白酶K消化，從中提取出完整的細胞核進行檢測。為了保證所提取出的細胞核大部分為腫瘤的細胞核， 同時還對這種制作陣列的方法是否適

7、用于mRNA的原位雜交及免疫細胞化學染色進行了驗證。 五.FISH檢測t(14；18)(q32；q21)染色體異位及bcl-2基因擴增 檢測t(14；18)(q32；q21)的FISH探針購于美國Vysis公司，該探針由兩部分組成：一種為IgH特異性位點探針，用SpectrumGreen標記，為綠色熒光；另一部分為bcl-2基因特異性位點探針，SpectrumOrange標記。 六.FISH檢測染色體3q27斷裂

8、及擴增 檢測3q27斷裂點的探針包含了分別以SpectrumGreen及SpectrumOrange標記的兩段bcl-6基因探針，長度分別為300kb及600kb，這兩段序列位于染色體3q27，其間有長約42kb的間隙，恰好跨越了3q27染色體的斷裂位點。利用3q27斷裂點探針組進行FISH時，正常的有絲分裂間期細胞核可以見到兩融合的信號(黃色信號或橙綠信號連在一起)；存在3q27斷裂的細胞核進行FISH時表現(xiàn)為一個橙色信號一個

9、綠色信號及一個融合信號或兩個橙色信號，兩個綠色信號。 如果在一個細胞核中發(fā)現(xiàn)了3個以上的融合信號或3個以上的單色信號，則確定為存在3q27的擴增。 七.統(tǒng)計學方法 分析各因素間關系時采用χ2檢驗，樣本例數(shù)較少時采用Fisher精確概率檢驗(Fisher'sExactTest)，等級資料采用兩獨立樣本非參數(shù)檢驗(Mann-WhitneyU)。 統(tǒng)計軟件使用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包。 結果

10、一.病例情況 按DLBCL診斷標準，共檢出DLBCL60例，其中男性35例，女性25例，平均年齡51歲(16歲-82歲)。 有36例經過正規(guī)的CHOP方案治療，其中男性22例，女性14例平均年齡50歲(16歲-82歲)。治療結果：治療顯效15例，部分有效13例，無效8例。 二.PCR檢測t(14；18)(q32；q21)染色體異位 在驗證我們創(chuàng)建的“無DNA原則”能否有效預防PCR污染的實驗中，用陽性質粒

11、污染操作者的手套，再按照我們的操作原則進行實驗，均未出現(xiàn)假陽性。 三.細胞及細胞核陣列的制作及應用結果 利用本研究的實驗方法進行細胞核提取，提取出的細胞核滴于載玻片上然后以蘇木素-伊紅染色觀察，發(fā)現(xiàn)細胞漿均已去除，細胞核懸液中雜質少，細胞核形態(tài)結構完整清晰。成功制作了60例DLBCL石蠟包埋組織提取的細胞核陣列及鼻咽癌細胞系，淋巴瘤細胞系的細胞陣列，每個細胞芯中含細胞數(shù)目為500-1500個，平均1100個。將制成的陣列

12、成功用于熒光原位雜交，mRNA原位雜交及細胞化學染色。 四.TMA對DLBCL進行亞分類結果 TMA技術改進結果：利用在本研究設計的陣列組的實驗方法，成功的在同一載玻片上排列了來自8個微陣列蠟塊的樣本，合計2,560個組織芯，640例組織。在脫蠟及HE染色效果良好，僅有個別組織芯脫落，本研究設計的組織芯間距為25微米，這樣就保證了即使在油鏡下也可以方便的找到相鄰的組織芯，這在進行FISH觀察中是非常有用的。 五.

13、DLBCL分子亞類與臨床因素的關系 在檢出的29例GCB類DLBCL中，治療顯效、部分有效、無效的例數(shù)分別為9(64.3％)、4(28.6％)、1(7.1％)；在31例non-GCBGCB類DLBCL中，分別為6(27.3％)、9(40.9％)、7(31.8％)；GCB療效好于non-GCB，P=0.021。以蛋白表型為基礎的分子分類與臨床治療效果有相關性。 六.DLBCLbcl-2基因及所在染色體區(qū)異常與蛋白表達及臨床

14、因素之間的關系 FISH檢測t(14；18)(q32；q21)陽性的10例病例中，GCB8(80.0％)例，non-GCB2(20.0％)例，而無t(14；18)的病例中，GCB及non-GCB所占的比例分別為21(42.0％)、29(58.0％)，有統(tǒng)計學差異(P=0.031)，PCR法檢測t(14；18)(q32；q21)陽性的5例均為GCB(P=0.022)。 七.DLBCLbcl-6基因及所在染色體區(qū)異常與蛋白表

15、達及臨床因素之間的關系 在60例DLBCL中，3q27染色體斷裂的有15例，無3q27染色體斷裂45例。存在3q27染色體斷裂的15例，BCL-6蛋白表達情況為BCL-6陽性3(20.0％)例，陰性12(80.0％)例。無3q27染色體斷裂45例中，BCL-6陽性25(55.6％)例，BCL-6陰性：20(44.4％)例。統(tǒng)計結果顯示P=0.017，有統(tǒng)計學意義，3q27染色體斷裂的病例，其BCL-6蛋白表達率降低。 結

16、論 1PCR實驗中采用我們自創(chuàng)的“無DNA原則”可有效預防污染。 2采用本文所創(chuàng)建的方法可以在石蠟包埋組織中提取出細胞核，制成細胞核微陣列，該陣列應用于FISH檢測，同一性好，節(jié)約實驗時間，降低了實驗成本。 3利用陣列組的方法可以在同樣大小的載玻片上排列更多的組織芯，制出更大，質量更好的組織微陣列。 4常規(guī)PCR方法檢測t(14；18)有可能發(fā)生假陽性，原因在于人類基因組中存在一些可以與傳統(tǒng)引物部分配對的

17、基因，通過半巢式PCR檢測可以避免假陽性的發(fā)生。 5以蛋白表型為基礎對DLBCL可進行亞分類，該分類與臨床療效有相關性。MUM1陰性的病例治療效果要好于MUM1陽性的病例，提示MUM1可做為臨床治療效果判斷的一個有用的指標。6在DLBCL病例中，t(14；18)(q32；q21)及bcl-2基因擴增均可引起B(yǎng)CL-2蛋白的表達。由t(14；18)(q32；q21)引起B(yǎng)CL-2蛋白表達的病例劃分為GCB的可能性大，由bcl-2基