HSP27在急性尿潴留致膀胱逼尿肌收縮功能障礙中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的：
　　急性尿潴留(Acuteurinaryretention，AUR)是臨床上常見的的泌尿外科急癥，主要為下尿路梗阻、神經(jīng)源性膀胱、硬膜外手術(shù)后以及某些藥物作用后常見的下尿路并發(fā)癥。AUR常造成膀胱功能的損害，長(zhǎng)時(shí)期的AUR可導(dǎo)致膀胱的功能恢復(fù)延遲，嚴(yán)重者可導(dǎo)致膀胱收縮功能的喪失。AUR后導(dǎo)致的膀胱收縮無(wú)力(Detrusorunderactivity，DU)發(fā)病率高，相當(dāng)一部分患者拔除尿管后再次出現(xiàn)AUR，具體機(jī)制尚不

2、完全清楚，且臨床上促進(jìn)膀胱收縮功能恢復(fù)的藥物很有限，療效均不確切。
　　膀胱正常的儲(chǔ)/排尿生理功能在很大程度上取決于膀胱逼尿肌細(xì)胞(Detrusorsmoothmusclecell，DSMC)的舒張與收縮特性。DSMC為膀胱組織的一種特殊平滑肌細(xì)胞，其舒張與收縮符合經(jīng)典的肌絲滑行理論。平滑肌收縮時(shí)，肌球蛋白粗絲與肌動(dòng)蛋白細(xì)絲本身長(zhǎng)度不發(fā)生變化，肌動(dòng)蛋白細(xì)絲插入肌球蛋白粗絲產(chǎn)生相對(duì)位移導(dǎo)致的肌細(xì)胞長(zhǎng)度變化。且神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)受體以及各

3、種收縮相關(guān)蛋白和多種酶等參與調(diào)控平滑肌細(xì)胞的收縮。而完整的細(xì)胞骨架是維持平滑肌可收縮性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。由于膀胱收縮功能的特殊性，從生理學(xué)的角度講，膀胱逼尿肌收縮的調(diào)控機(jī)制與骨骼肌十分相似，即對(duì)收縮可控性和精確性要求較高，因此精密和穩(wěn)定的粗細(xì)肌絲結(jié)構(gòu)是保證逼尿肌正常收縮的基礎(chǔ)。很多相關(guān)報(bào)道也發(fā)現(xiàn)AUR后膀胱的過(guò)度牽張至膀胱逼尿肌細(xì)胞骨架的嚴(yán)重受損是膀胱逼尿肌收縮功能障礙的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　熱休克蛋白分子27(Heatshockprotei

4、n27，HSP27)是一類重要的分子伴侶，是最早發(fā)現(xiàn)、也是最具代表性的小分子熱休克蛋白之一，在平滑肌的收縮功能的調(diào)節(jié)中起重要作用。HSP27在既往的血管、子宮及支氣管平滑肌的研究中證實(shí)了平滑肌組織在應(yīng)激狀態(tài)下HSP27的表達(dá)和活化狀態(tài)可代償性增加并有助于維持和重建肌細(xì)胞的收縮功能。HSP27的磷酸化是其活性形式，p38MAPK及p38MAPK激活的蛋白激酶、蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)是其磷酸化的上游信號(hào)通路。HS

5、P27有3個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為Ser15、Ser78和Ser82。磷酸化的HSP27可通過(guò)抑制絲狀肌動(dòng)蛋白(F-Actin)的解聚和促進(jìn)球狀肌動(dòng)蛋白(G-Actin)的聚合發(fā)揮穩(wěn)定平滑肌細(xì)胞骨架和增強(qiáng)細(xì)胞收縮力的功能。目前HSP27在AUR后膀胱逼尿肌收縮功能中的作用未見報(bào)道。
　　本研究通過(guò)建立AUR動(dòng)物模型，通過(guò)HE染色、透射電鏡觀察AUR后膀胱形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，采用膀胱測(cè)壓、離體膀胱肌條收縮實(shí)驗(yàn)測(cè)定AUR后膀胱功能的改變;通過(guò)

6、免疫熒光染色，RT-PCR及Westernblot等技術(shù)，研究AUR后不同時(shí)相點(diǎn)大鼠膀胱HSP27的表達(dá)情況，探討AUR后膀胱平滑肌HSP27蛋白的表達(dá)和磷酸化在膀胱收縮功能障礙中的作用及相關(guān)機(jī)制;構(gòu)建人的HSP27的過(guò)表達(dá)及干擾的慢病毒載體，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染人的膀胱平滑肌細(xì)胞，觀察HSP27對(duì)膀胱平滑肌細(xì)胞的收縮力的影響，探索逼尿肌收縮功能障礙的保護(hù)措施、治療靶點(diǎn)和預(yù)后評(píng)估提供新的思路與依據(jù)。
　　方法:
　　本課題以健康成

7、年雌性SD大鼠為研究對(duì)象，通過(guò)膀胱灌注，結(jié)扎外尿道口的方法建立大鼠急性尿潴留動(dòng)物模型，按急性梗阻后不同的時(shí)相點(diǎn)分組(0h、1h、6h、12h、24h、3d、7d);通過(guò)HE染色、透射電鏡觀察AUR后膀胱形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化;采用膀胱測(cè)壓、離體膀胱肌條收縮實(shí)驗(yàn)測(cè)定AUR后膀胱收縮功能的改變;通過(guò)免疫熒光染色，RT-PCR及Westernblot技術(shù)，研究AUR后不同時(shí)相點(diǎn)大鼠膀胱HSP27的表達(dá)情況，通過(guò)構(gòu)建HSP27的過(guò)表達(dá)及干擾病毒載體，感

8、染膀胱平滑肌細(xì)胞，并通過(guò)構(gòu)建平滑肌人造肌條觀察HSP27對(duì)膀胱平滑肌細(xì)胞收縮力的影響;探討AUR后HSP27蛋白在膀胱收縮功能障礙中的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1、AUR后可導(dǎo)致大鼠膀胱的組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損害，其特點(diǎn)為:各層組織損害的表現(xiàn)不同，其中以黏膜及黏膜下層的損害最為明顯;AUR解除梗阻后6h內(nèi)最為嚴(yán)重，而后結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)。
　　2、AUR后膀胱逼尿肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，AUR0h逼尿肌細(xì)胞內(nèi)致密體增多，排

9、列紊亂，AUR后1-12h細(xì)胞內(nèi)致密體減少，排列無(wú)規(guī)則，線粒體水腫，結(jié)構(gòu)不清，胞漿內(nèi)出現(xiàn)許多空泡;而后其超微結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)正常。
　　3、AUR后導(dǎo)致大鼠膀胱收縮功能受損，AUR后6h內(nèi)最大逼尿肌壓、離體肌條收縮力均逐漸降低，急性梗阻解除6h后膀胱收縮功能逐漸恢復(fù)。
　　4、與正常對(duì)照組比較，AUR0h組大鼠膀胱組織中HSP27的mRNA及蛋白表達(dá)升高(P＜0.05);與AUR0h比較，AUR6h組的表達(dá)最低(P＜0.05)，

10、AUR解除梗阻6h后，HSP27的表達(dá)逐漸恢復(fù)。
　　5、急性梗阻解除后6h，三種磷酸化的HSP27蛋白含量最低(與AUR0h組比較，P＜0.05)，而急性梗阻解除6h后三種磷酸化HSP27蛋白的表達(dá)逐漸升高。
　　6、成功構(gòu)建了能高表達(dá)及干擾HSP27的慢病毒載體質(zhì)粒，感染膀胱平滑肌細(xì)胞后并能高效、特異的促進(jìn)和抑制HSP27的表達(dá)。
　　7、與正常膀胱平滑肌細(xì)胞構(gòu)建的人造肌條相比，HSP27過(guò)表達(dá)組的人造肌條收縮力增

11、大(p＜0.05);HSP27干擾組的人造肌條收縮力降低(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、AUR后大鼠膀胱的組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損害，膀胱逼尿肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)也有一定程度的損害，并都具有一定的時(shí)相特異性，其特點(diǎn)是:在AUR解除梗阻后6h內(nèi)，膀胱組織結(jié)構(gòu)、逼尿肌超微結(jié)構(gòu)受損逐漸加重，而后逐漸恢復(fù)。
　　2、AUR后大鼠膀胱逼尿肌收縮功能受損，且具有時(shí)相特異性，即在AUR解除梗阻后6h內(nèi)，膀胱的收縮力逐漸降低，而后膀胱收縮功

12、能逐漸恢復(fù)。
　　3、AUR后大鼠膀胱逼尿肌HSP27的表達(dá)變化趨勢(shì)與AUR后大鼠膀胱收縮功能的變化趨勢(shì)一致，并具有相關(guān)性。AUR后膀胱HSP27的高表達(dá)對(duì)膀胱逼尿肌細(xì)胞有保護(hù)作用。
　　4、成功構(gòu)建了能高表達(dá)及干擾HSP27的慢病毒載體質(zhì)粒，感染膀胱平滑肌細(xì)胞后并能高效、特異的促進(jìn)和抑制HSP27的表達(dá)。
　　5、成功構(gòu)建了膀胱平滑肌細(xì)胞的人造肌條，在KCl誘導(dǎo)的收縮研究中發(fā)現(xiàn)HSP27的表達(dá)水平與膀胱平滑肌的收縮密