DHBV模型定量評價體系的建立及用于評價中藥復(fù)方抑制DHBV作用.pdf

1、目前全世界大約有4億人感染了乙肝病毒 (HepatitisBVirus，HBV)，每年因此有30萬人成為肝癌患者，每年因HBV感染而死亡的人數(shù)為50—120萬；全世界有1/3 的人在其一生中會感染上 HBV，HBV 慢性感染率從2％—20％不等，對于HBV的研究一直是熱點問題。 DHBV與HBV同屬嗜肝 DNA 病毒科，DHBV 與 HBV 在復(fù)制形式、致病機理等方面有著眾多的相似之處，所以鴨乙肝模型一直被用作抗HBV藥物篩選及

2、HBV致病機理研究的動物模型；多年來對于DHBV檢測一直采用斑點雜交，該方法具有可進行大規(guī)模檢測、價格便宜等優(yōu)勢，但精確性不高；而且目前鴨乙肝模型評價藥效一般給藥10天，這對于藥效溫和的中藥抑制DHBV作用評價則時間太短，且斑點雜交精確性也不高； 鴨胚肝細胞模型一直在國外被認為是唯一一類病毒直接感染、復(fù)制的原代細胞模型，很受重視。而其培養(yǎng)上清中的DHBV變化要用斑點雜交進行評價則很困難，且不準確。因此本研究建立了DHBV體內(nèi)外模

3、型的定量評價體系，并用該評價體系對中藥復(fù)方的抑制DHBV作用進行了評價。 1.通過對Genbank中所公布的所有 DHBV 全基因序列進行對比，找出保守序列，設(shè)計了DHBV熒光定量PCR引物和探針，并構(gòu)建了包含該套引物探針靶序列的DHBV熒光定量PCR標準品質(zhì)粒。用探針檢測標準品后表明，該方法在8個濃度梯度范圍具有良好的線性關(guān)系，能夠很好的檢測最高 2×10<'7>—2copy/25μL 反應(yīng)體系。批內(nèi)差異最大只有2.03％，批

4、間最大變異系數(shù)僅為 2.47％。 2.通過對NP—40 提取法、辛酸鈉提取法和達暉生物公司的血清病毒DNA提取試劑盒的對比，最終表明了辛酸鈉法與達暉生物試劑盒提取效果相似，NP—40法效果較差。辛酸鈉法是適合于DHBV 熒光定量PCR標本提取的高效、經(jīng)濟的方法。 3.用普通PCR方法對100只1日齡廣東麻鴨進行DHBV 陽性篩選，用篩選所得先天感染DHBV的鴨作為模型動物對扶正利濕活血復(fù)方水煎劑進行抑制DHBV效果評價，

5、共給藥1個月，分別于開始給藥當(dāng)天(DO)、給藥第10天 (D10)、給藥第20天(D20)、給藥第30天(D30)及停藥第5天(P5)采集血清，用熒光定量PCR法進行檢測，結(jié)果表明，扶正利濕活血復(fù)方高、低劑量組在給藥后第10、20、30天時均可使先天感染鴨乙肝模型血清DHBV載量明顯降低，停藥5天后也有一定抑制作用。 4.分別對DHBV先天感染和后天感染的鴨胚肝細胞培養(yǎng)上清中DHBV在載量動態(tài)變化進行檢測，結(jié)果表明，先天感染的鴨

6、胚肝細胞中，細胞接種后第1天上清中的病毒含量最高，第2天則有所下降，隨后逐漸上升，至第6天后達到穩(wěn)定波動，但都達不到第一天的水平。但是先天感染DHBV鴨胚肝細胞上清中DHBV載量都在10<'8>內(nèi)波動。因此較為穩(wěn)定。 在后天DHBV 感染的鴨胚肝細胞中，DHBV感染時間是在細胞長成單層以后，但其上清中仍然出現(xiàn)了DHBV感染后第一天DHBV載量最高，第二天大幅下降，第三天逐步上升，一直至DHBV感染后第11天達到最高值。這與以前用

7、斑點雜交檢測認為DHBV感染后第六天培養(yǎng)上清中的DHBV達到高峰明顯不同。但后天感染DHBV 的鴨胚肝細胞培養(yǎng)上清中的DHBV 載量波動幅度較大，波動范圍為le5—le8copy/ml之間。 本研究分別以20ul、50ul、100ulDHBV 陽性血清感染鴨胚肝細胞，這三種DHBV 感染劑量均在第11天時DHBV達到高峰，DHBV含量只在感染后前2天有明顯差別，隨后均無明顯區(qū)別。 5.用先天感染DHBV的鴨胚肝細胞對扶正

8、利濕活血復(fù)方的水提物和醇提物進行抑制DHBV藥效評價，共給藥5天，結(jié)果表明，扶正利濕活血復(fù)方水提物3個劑量組均無明顯抑制鴨胚肝細胞培養(yǎng)上清中的DHBV作用，而其醇提物則顯示明顯抑制作用，這表明扶正利濕活血復(fù)方水煎劑在鴨體內(nèi)可能不是通過直接抑制DHBV而起作用。扶正利濕活血復(fù)方醇提物顯示了明顯抑制鴨胚肝細胞培養(yǎng)上清中DHBV的作用，說明醇提物中的成分不同于水提物，其中可能含有直接抑制DHBV作用的物質(zhì)，值得進一步研究。 本文完整的

9、建立了熒光定量PCR檢測DHBV的方法，使DHBV檢測敏感性、精確性大大提高；建立了經(jīng)濟而精確高效的血清DHBV提取方法，整合于DHBV定量PCR方法中，使DHBV定量檢測可以經(jīng)濟而精確的大規(guī)模應(yīng)用。首次將鴨乙肝動物模型給藥時間延長至1月，使之更適合于中藥抑制HBV藥效評價；首次用熒光定量PCR方法檢測了先天感染、后天感染DHBV的鴨胚肝細胞培養(yǎng)上清中DHBV載量的動態(tài)變化，并表明先天感染鴨胚肝細胞培養(yǎng)上清中DHBV載量變化在一個數(shù)量級

10、之內(nèi)，比后天感染更適合于抗HBV藥效體外評價。通過這些建立了抗DHBV藥效體內(nèi)外定量評價體系，在抗HBV 藥物體內(nèi)外模型研究方面作出了創(chuàng)新性工作，提高了模型的精確性、敏感性。 本文還利用建立的抗DHBV藥效體內(nèi)外定量評價體系評價了中藥扶正利濕活血復(fù)方的抑制DHBV作用，表明該復(fù)方水煎劑在給藥1月內(nèi)在體內(nèi)能夠明顯降低血清中的DHBV載量；體外在上藥5天內(nèi)，水提物3個劑量均無明顯抑制DHBV作用，而醇提物3個劑量均有一定抑制DHBV