MLL-AF9對(duì)急性單核白血病細(xì)胞增殖的影響及其分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、第一部分: 目的: 從急性單核白血病細(xì)胞系THP-1中克隆出MLL-AF9融合基因斷裂點(diǎn)序列，并對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定分析。 方法: 利用RT-PCR方法從急性單核白血病細(xì)胞系THP-1中擴(kuò)增出MLL-AF9融合基因斷裂點(diǎn)附近序列，并用T-A克隆方法將其克隆至T載體上，經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)行序列測(cè)定分析。 結(jié)果：從急性單核白血病細(xì)胞系THP-1克隆出了MLL-AF9斷裂點(diǎn)附近序列，大小為528bp，測(cè)序后示MLL基因斷裂點(diǎn)

2、位于外顯子9，與AF9基因外顯子5發(fā)生融合。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功克隆了THP-1細(xì)胞系MLL-AF9斷裂點(diǎn)的 cDNA序列，為針對(duì)該序列設(shè)計(jì)特異性的siRNA進(jìn)行基因沉默實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。 第二部分： 目的：研究MLL-AF9融合基因?qū)毙詥魏税籽〖?xì)胞系THP-1細(xì)胞增殖的影響。 方法：選擇THP-1細(xì)胞特有的MLL-AF9融合基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)并合成siRNA片段。以人急性單核白血病細(xì)胞系THP-1為靶細(xì)胞，

3、應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR法比較轉(zhuǎn)染前后MLL-AF9 mRNA表達(dá)水平的變化，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增生抑制率，并通過(guò)Hoechst33258染色觀察siRNA作用于THP-1后細(xì)胞凋亡形態(tài)特征，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平和細(xì)胞周期的改變。 結(jié)果：siRNA轉(zhuǎn)染效率為69.1％±1.8％，轉(zhuǎn)染siRNA后MLL-AF9基因表達(dá)量大幅度減少（P<0.01），THP-1生

4、長(zhǎng)受到明顯抑制，G0/G1期細(xì)胞增多（P<0.01），S期細(xì)胞減少（P<0.01），并使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期；凋亡小體增多，凋亡水平增加（P<0.01），而對(duì)照組則無(wú)上述表現(xiàn)（P>0.05）。 結(jié)論：MLL-AF9融合基因維持和促進(jìn)人急性單核白血病細(xì)胞THP-1的增殖。 第三部分： 目的：研究MLL-AF9融合基因?qū)θ思毙詥魏税籽〖?xì)胞系THP-1的p27表達(dá)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。 方法：選擇THP-1

5、細(xì)胞特有的MLL-AF9融合基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)并合成siRNA片段。應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR法比較轉(zhuǎn)染前后MLL-AF9 mRNA表達(dá)水平的變化，Western Blot檢測(cè)MLL-AF9蛋白水平沉默效果，比較細(xì)胞周期抑制蛋白p27表達(dá)變化，利用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）研究MLL-AF9融合蛋白是否與p2