霍亂弧菌HutX蛋白的提取和血紅素結(jié)合能力研究.pdf

1、鐵元素的獲取對(duì)于霍亂弧菌的生存和繁殖起著至關(guān)重要的作用。雖然自然界鐵元素的含量豐富，但是由于鐵的不穩(wěn)定性，在富含水和氧氣的外界環(huán)境中容易發(fā)生氧化還原反應(yīng)，其產(chǎn)物難以被微生物利用;在人體中，大量的鐵以結(jié)合鐵蛋白的形式存在，游離的二價(jià)鐵離子含量極少，難以滿足霍亂弧菌的生存要求，因此霍亂弧菌必須奪取血紅素中的鐵元素來(lái)滿足自身生存和繁殖的需要。
　　 目前，人們已經(jīng)對(duì)霍亂弧菌獲取和轉(zhuǎn)運(yùn)血紅素的機(jī)制十分了解。大量研究發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌自身可以釋

2、放具有高親和力的小分子蛋白——載鐵素，載鐵素能夠高效的結(jié)合宿主體內(nèi)的血紅素，并通過(guò)TonB系統(tǒng)帶回到細(xì)胞周質(zhì)，再由PBP將鐵元素轉(zhuǎn)給ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，ABC系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞體。然而，由于血紅素不能直接被霍亂弧菌利用，且大量聚集的血紅素對(duì)細(xì)胞膜有破壞作用，所以進(jìn)入細(xì)胞的血紅素仍需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的生化反應(yīng)降解血紅素并獲取其中的鐵元素。但是對(duì)于血紅素進(jìn)入胞體之后的命運(yùn)研究者卻知之甚少。
　　 有研究認(rèn)為霍亂弧菌的HutZ蛋白可能參與了血紅素的

3、胞內(nèi)降解反應(yīng)，具有降解酶或者暫時(shí)儲(chǔ)存血紅素的作用。因此我們猜測(cè)與HutZ蛋白共用一個(gè)啟動(dòng)子，同時(shí)表達(dá)的HutX蛋白也可能參與了這一反應(yīng)過(guò)程。HutX蛋白屬于HutX-ChuX超蛋白家族，具有保守結(jié)構(gòu)域DUF1008，該家族的其他蛋白均被證明具有血紅素結(jié)合能力，如HemS蛋白具有血紅素降解酶的功能，與HutX蛋白同源性最高的ChuX蛋白近期也被證明可以與血紅素結(jié)合。先前研究認(rèn)為ChuX在大腸桿菌的鐵元素利用過(guò)程中起到短時(shí)間儲(chǔ)存血紅素的作用

4、，以防止?jié)撛诳赡艿难t素毒性促進(jìn)非氧化還原反應(yīng)破壞細(xì)胞膜。因此，我們認(rèn)為HutX具有潛在的血紅素結(jié)合能力，并參與了血紅素胞內(nèi)利用的反應(yīng)過(guò)程。
　　 目的:
　　 驗(yàn)證霍亂弧菌HutX蛋白是否具有血紅素結(jié)合能力，并分析與血紅素結(jié)合能力相關(guān)的蛋白結(jié)構(gòu)，以此推測(cè)HutX蛋白在霍亂弧菌鐵元素?cái)z取及利用過(guò)程中的作用。
　　 方法:
　　 為了證實(shí)我們的推測(cè)，我們采用霍亂弧菌01 biovar EI Tor str.

5、N16961的基因組為模板翻譯表達(dá)出HutX蛋白，通過(guò)鎳柱親和層析、SourceQ陰離子交換柱層析和Superdex200分子篩柱層析等純化所得蛋白，利用蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行驗(yàn)證，獲取純化的HutX蛋白與血紅素按照一定的比例充分混合后，進(jìn)行分光光度測(cè)量，并對(duì)光譜進(jìn)行分析;在驗(yàn)證HutX蛋白具有血紅素結(jié)合能力后，為了進(jìn)一步分析HutX蛋白與血紅素結(jié)合的氨基酸殘基以及結(jié)合方式，我們通過(guò)對(duì)已知同源蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，推測(cè)HutX蛋白與血紅素的結(jié)合

6、位點(diǎn)，在驗(yàn)證過(guò)程中，我們對(duì)潛在結(jié)合位點(diǎn)突變后純化獲取突變的HutX蛋白，與血紅素按相同比例結(jié)合后進(jìn)行分光光度測(cè)量，并與野生型HutX-血紅素復(fù)合物的光譜進(jìn)行對(duì)照。
　　 結(jié)果:
　　 通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)證實(shí)我們獲取的蛋白為純化的HutX蛋白，野生型HutX蛋白-血紅素復(fù)合物所得光譜證明HutX蛋白與血紅素形成的復(fù)合物所得光譜中存在一大一小兩個(gè)波峰，對(duì)比已知物質(zhì)的光譜結(jié)果以及同源類似物的光譜結(jié)果，可以得知HutX蛋白與血紅素以六

7、配位鍵的形式結(jié)合，該結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，不易于其他物質(zhì)發(fā)生變化，但是HutX蛋白-血紅素復(fù)合物的小波峰較典型的六配位鍵物質(zhì)光譜結(jié)果中的小波峰小，而趨向于五配位鍵的結(jié)合形式，所以我們認(rèn)為HutX蛋白與血紅素應(yīng)該以五配位鍵、六配位鍵混合的方式與血紅素結(jié)合，在溶液中兩種結(jié)合方式達(dá)到平衡，與ChuX蛋白的結(jié)合方式相似。我們進(jìn)一步通過(guò)對(duì)HutX蛋白的同源蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)在HutX蛋白的同源類似物中均存在一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，先前對(duì)HemS和ChuX蛋

8、白的結(jié)構(gòu)和功能研究已經(jīng)證明該結(jié)構(gòu)中存在血紅素結(jié)合位點(diǎn)，且該位點(diǎn)為保守的氨基酸序列，通過(guò)氨基酸序列比對(duì)，我們推測(cè)得到兩個(gè)潛在的HutX蛋白與血紅素的結(jié)合位點(diǎn)，H103和F119，紫外-可見(jiàn)光譜結(jié)果顯示對(duì)兩個(gè)位點(diǎn)分別進(jìn)行突變后大小兩個(gè)波峰均消失，僅在波長(zhǎng)值約為200nm處獲得一個(gè)單一的波峰，有可能為HutX二聚體蛋白波峰。因此可以認(rèn)為突變的HutX蛋白失去血紅素結(jié)合能力，說(shuō)明H103和F119均是HutX蛋白結(jié)合血紅素的關(guān)鍵位點(diǎn)。
　

9、　 結(jié)論:
　　 該實(shí)驗(yàn)證明了HutX蛋白具有血紅素結(jié)合能力，但是HutX-血紅素復(fù)合物不穩(wěn)定，與其結(jié)合的鐵元素處于活躍狀態(tài)，容易與其他化合物發(fā)生反應(yīng)。因此我們認(rèn)為HutX蛋白可能具有短暫儲(chǔ)存血紅素以減少細(xì)胞內(nèi)血紅素水平。在霍亂弧菌獲取到大量血紅素的時(shí)候，HutX蛋白結(jié)合血紅素，以保證積累的血紅素毒性不會(huì)破壞霍亂弧菌的細(xì)胞膜而導(dǎo)致細(xì)胞死亡;同時(shí)，由于HutX蛋白與血紅素結(jié)合不緊密，所以其他蛋白可以很容易的從HutX蛋白和血紅素

10、的復(fù)合物中獲取血紅素，提取其中二價(jià)鐵離子加以利用。因此，HutX蛋白以五配位鍵、六配位鍵方式與血紅素的結(jié)合即有利于對(duì)細(xì)胞膜的保護(hù)，也有利于對(duì)血紅素及二價(jià)鐵離子的利用。先前對(duì)ChuX蛋白的研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的ChuX蛋白具有與HutX蛋白類似的功能，考慮到來(lái)兩個(gè)蛋白在氨基酸序列以及結(jié)構(gòu)上的高度相似性，該研究支持了我們的結(jié)論。我們的研究證明HutX蛋白的血紅素結(jié)合能力和結(jié)合位點(diǎn)，并依據(jù)此對(duì)HutX蛋白的功能進(jìn)行了推測(cè)和討論，為進(jìn)一步研究該蛋白