周期誘導(dǎo)聯(lián)合化療后耐藥腫瘤細(xì)胞亞群與腫瘤干細(xì)胞相關(guān)性的研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：探討通過(guò)誘導(dǎo)靜止期腫瘤細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，增強(qiáng)腫瘤對(duì)化療藥物敏感性的可行性及其作用機(jī)制。
　　 材料和方法：在體外試驗(yàn)中，分別以體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株和原代結(jié)腸癌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，給予EGF 作用一定時(shí)間后用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖狀況及CD133+細(xì)胞比例變化，并將分選后的CD133+細(xì)胞經(jīng)EGF 刺激后檢測(cè)細(xì)胞增殖狀況；給予腫瘤細(xì)胞EGF 及5-Fu 聯(lián)合作用一定時(shí)間后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢

2、測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖狀況。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，分別建立人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株和原代結(jié)腸癌細(xì)胞的裸鼠移植瘤模型，經(jīng)給予EGF和5-Fu 處理一段時(shí)間后，通過(guò)記錄各組腫瘤生長(zhǎng)狀況的各項(xiàng)指標(biāo)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，分析評(píng)估周期誘導(dǎo)是否增強(qiáng)化療藥物的治療效果。
　　 結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)中：1）EGF 作用后腫瘤細(xì)胞S+G2/M 期比例增多，Ki67表達(dá)增高，促進(jìn)更多細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期增殖；EGF 作用后CD133+細(xì)胞比例增加，且其中進(jìn)入增殖期的細(xì)

3、胞比例也增加；2）5-Fu 作用后腫瘤細(xì)胞S+G2/M 期細(xì)胞比例減少，同時(shí)細(xì)胞凋亡增多；3）聯(lián)合使用EGF和5-Fu后，腫瘤細(xì)胞凋亡率高于單獨(dú)使用5-Fu組。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中：1）給予EGF后裸鼠移植瘤S+G2/M 期細(xì)胞比例增多，Ki67表達(dá)增高；CD133+細(xì)胞比例增加。2）不同方案給藥干預(yù)后，”EGF+5-Fu”組腫瘤重量小于5-Fu組。
　　 結(jié)論：
　　 1）EGF 能促使結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期并發(fā)生增殖，其中包括

4、對(duì)CD133+的結(jié)腸癌細(xì)胞。
　　 2）EGF 能夠增強(qiáng)化療藥物的對(duì)腫瘤的治療效果，其機(jī)制可能是使CSCs 進(jìn)入細(xì)胞周期發(fā)生增殖，從而增加其對(duì)化療藥物的敏感性。
　　 第二部分
　　 目的：研究EGF 進(jìn)行周期誘導(dǎo)聯(lián)合化療后耐藥腫瘤細(xì)胞的特性。
　　 方法：將體外實(shí)驗(yàn)中EGF周期誘導(dǎo)聯(lián)合化療后獲得的殘余細(xì)胞進(jìn)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期主要細(xì)胞周期素（cyclin）的表達(dá)，并通過(guò)PI 法進(jìn)行細(xì)胞周期分布分析

5、；CFSE 熒光法檢測(cè)細(xì)胞增殖以及細(xì)胞分裂狀況；再次給予化療藥物5-Fu后通過(guò)Annexin-V/PI 檢測(cè)細(xì)胞凋亡率來(lái)明確該部分細(xì)胞的耐藥性。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)第一部分研究中各組裸鼠移植瘤細(xì)胞主要cyclin的表達(dá)以及細(xì)胞周期分布情況；將各組腫瘤取出后繼續(xù)傳代，并記錄腫瘤生長(zhǎng)曲線；給予化療藥物5-Fu后研究各組腫瘤對(duì)化療藥物的耐藥性。
　　 結(jié)果：（1）細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)：“EGF+5-Fu”組各主要cyclin表達(dá)明顯低于其他各組

6、，但各組細(xì)胞未見(jiàn)明顯的細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象；CFSE 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)“EGF+5-Fu”組細(xì)胞分裂以及增殖速度明顯低于其他各組；再次給予5-Fu后，“EGF+5-Fu”組細(xì)胞凋亡率較其他組明顯降低。2）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：“EGF+5-Fu”組細(xì)胞各主要cyclin表達(dá)明顯低于其他各組，但各組細(xì)胞未見(jiàn)明顯周期阻滯現(xiàn)象；各組腫瘤再次傳代后，“EGF+5-Fu”組生長(zhǎng)速度明顯高于其他各組，繼續(xù)給予5-Fu 化療后，“EGF+5-Fu”組腫瘤重量高于其他各組，

7、HE切片顯示其惡性程度更高。
　　 結(jié)論：EGF周期誘導(dǎo)聯(lián)合化療后殘余的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞中一群cyclins表達(dá)很低、細(xì)胞周期運(yùn)行很慢的腫瘤細(xì)胞，且其具有更高的惡性程度和很強(qiáng)的耐藥性，很有可能是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)耐藥的原因。
　　 第三部分
　　 目的：研究周期誘導(dǎo)聯(lián)合化療后耐藥腫瘤細(xì)胞是否具有CSCs的特性。
　　 方法：體外實(shí)驗(yàn)中，用連續(xù)傳代檢測(cè)原代結(jié)腸癌“EGF+5-Fu”組細(xì)胞的自我更新能力；克隆形成試驗(yàn)

8、檢測(cè)原代結(jié)腸癌“EGF+5-Fu”組細(xì)胞的成瘤能力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，用成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)原代結(jié)腸癌“EGF+5-Fu”組細(xì)胞的成瘤能力，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)相關(guān)CSCs基因表達(dá)及CSCs表面標(biāo)志。
　　 結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn):“EGF+5-Fu”組細(xì)胞自我更新能力和成瘤能力強(qiáng)于其他各組細(xì)胞。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：“EGF+5-Fu”組細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤能力強(qiáng)于其他各組細(xì)胞，“EGF+5-Fu”組細(xì)胞sox2、notch2表達(dá)較其他組增高，CD133 有相應(yīng)表