脂筏在細(xì)胞信號(hào)特異性調(diào)節(jié)M通道功能中的作用.pdf

1、M電流是廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)的一種鉀電流,是影響神經(jīng)元興奮性的主要機(jī)制之一,是唯一在神經(jīng)元閾電位附近激活的電流,它的功能降低可以引起神經(jīng)元興奮性增高,誘發(fā)癲癇等疾病。眾多神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽可以調(diào)節(jié)M電流進(jìn)而影響神經(jīng)元興奮性。近年來(lái),對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)等調(diào)節(jié)M電流的分子機(jī)制有了很大進(jìn)展,其中以乙酰膽堿激活M型膽堿受體(M1)和緩激肽激活其Ⅱ型緩激肽受體(B2受體)后調(diào)節(jié)M電流的分子機(jī)制最有代表性。雖然兩種受體激活都可以抑制M電流,但其分子機(jī)制有所不同

2、,其中對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度影響的不同是關(guān)鍵之處。然而,對(duì)于造成這一不同的進(jìn)一步機(jī)制則有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)試圖從細(xì)胞膜脂筏(lipidraft)的角度來(lái)解釋不同膜受體介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路對(duì)M電流調(diào)節(jié)不同的機(jī)制。
　　 脂筏是細(xì)胞膜上的一種脂質(zhì)微區(qū),在大多數(shù)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞膜上都有分布,一般大小為55-300 nm,富含膽固醇和鞘磷脂,具有低浮力密度和不溶于去污劑的特性。近期研究表明,脂筏在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件中發(fā)揮著重要的作用;脂筏中特異聚

3、集的不同信號(hào)分子可能決定了不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的特異性。本研究將以與M1受體、B2受體以及所相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)分子在脂筏中分布的異同為中心,觀察脂筏在M電流的特異性調(diào)節(jié)中的作用。
　　 目的:研究大鼠頸上神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞膜脂筏在膜受體特異調(diào)節(jié)M電流中的作用。
　　 方法:
　　 1、脂筏提取及脂筏中膜蛋白的鑒定。
　　 1.1蔗糖密度梯度離心法分離脂筏及脂筏的鑒定。
　　 摘取40只7天SD大鼠SCG,用

4、玻璃勻漿器進(jìn)行勻漿,離心5000 rpm,5 min。取上清。將約1.5ml上清置于8.9 ml離心管底部,加入80％蔗糖1.5ml,輕輕混勻避免氣泡的產(chǎn)生,在液面上方緩慢加入3 ml35％蔗糖,同法操作,再加入約3 ml5％蔗糖,制備40％/35％/5％的蔗糖梯度。39,000 rpm,4℃,離心21 h。將離心后的液體從上到下連續(xù)取出九個(gè)部分,每部分約一毫升。從每個(gè)部分中取出4μl,均勻地點(diǎn)于尼龍膜上,進(jìn)行Dot blots實(shí)驗(yàn),利

5、用霍亂毒素B測(cè)定神經(jīng)節(jié)苷脂GM1在九個(gè)部分的分布情況,而GM1是脂筏的標(biāo)記分子之一。
　　 1.2去污劑法分離脂筏
　　 摘取10只7天SD大鼠SCG,用玻璃勻漿器勻漿,離心5,000 rpm,10 min,取上清,40,200 rpm,4℃,1 h。沉淀用200μl含500 mM Na2CO3及1％triton低滲勻漿Buffer懸浮并超聲,冰上靜置30 min,15,000 g,4℃,30 min,分成去污劑溶解與不

6、溶兩種組分,然后用5×SDS-PAGE上樣緩沖液變性。
　　 1.3 M1受體、B2受體及相關(guān)信號(hào)分子在膜脂筏中分布的鑒定
　　 將超速離心后的九部分及去污劑溶解部分與不溶部分經(jīng)12％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)移至NC膜。膜用5％的脫脂奶粉常溫下封閉1小時(shí)。分別加特異性的抗體孵育過(guò)夜。抗體有單克隆抗體caveolin-1(1:1000),B2受體(1:1000),多克隆抗體M1(1:200),Gq(1:200

7、),G11(1:200),PLCβ4(1:200),PLCβ1(1:200)。然后用TBST洗膜液洗膜三次,每次10分鐘。加相應(yīng)的熒光二抗(1:4000),室溫孵育3-4小時(shí)。洗膜后用Odyssey9120雙色紅外激光成像系統(tǒng)顯色分析。
　　 2、M電流記錄
　　 分離培養(yǎng)頸上神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元,打孔膜片鉗記錄M電流。將細(xì)胞鉗制在-20 mV,然后復(fù)極化到.60 mV,記錄膜電位在-60 mV時(shí)M電流的尾電流。比較甲基環(huán)糊精(

8、Mp CD)處理前后給予OXO-M(5μM)和BK(100 nM)后M電流的抑制情況。
　　 3、細(xì)胞內(nèi)Ca2+測(cè)定
　　 使用熒光探針Flu-4-AM(2.5 nmol/L)和透膜劑F127(0.02％)標(biāo)記鈣離子,室溫孵育30分鐘,使染料進(jìn)入細(xì)胞。用0.01 M PBS清洗細(xì)胞三次,然后用激光共聚焦顯微鏡觀察環(huán)糊精處理前后再給予緩激肽刺激時(shí)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化情況。
　　 4、免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫共沉淀

9、　　 4.1免疫細(xì)胞化學(xué)觀察caveolin-1與B2受體和M1受體的共定位。將細(xì)胞用4％多聚甲醛固定后,用含0.2％Triton-100的PBS作用30分鐘,增加通透性,然后加入特異性的一抗和熒光標(biāo)記的二抗或三抗,用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察鼠cavolin-1與鼠B2受體和兔MI受體的共定位情況。
　　 4.2免疫共沉淀方法觀察頸上神經(jīng)節(jié)中IP3受體與B2受體之間的相互關(guān)系。摘取SCG組織并用玻璃勻漿器勻漿后,離心5000

10、rpm,10 min。取上清,加入2μl IP3抗體,4℃,60 rpm振搖過(guò)夜,次日加入protein G beads,4℃,60 rpm,4 h后洗滌珠子,將純化后的蛋白免疫復(fù)合物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,電轉(zhuǎn)移至NC膜上,用脫脂奶粉封閉后,用B2抗體和熒光染料標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè),顯色結(jié)果用Odyssey9120雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描分析。
　　 結(jié)果:
　　 1、在大鼠頸上神經(jīng)節(jié)中有脂筏的存在,其特異性蛋白c

11、aveolin-1分布于蔗糖密度梯度離心分離組份的第3,4,5層(共9層),且第4層含量最多。脂筏的另一標(biāo)記物GMl分布于1-5層,其中在1-3層含量較多。
　　 2、B2受體、Gq、G11、PLCβ4和PLCβ1都在脂筏中有分布,而M1受體少見(jiàn)于脂筏中。
　　 3、用1％triton X-100處理膜樣品之后,在不溶解于去污劑的部分中通過(guò)Western blots可以檢測(cè)到caveolin-1、B2受體、M1受體、PL

12、Cβ1、PLCβ4、Gq、G11的存在。就B2受體和Ml受體而言,B2受體在去污劑不溶的部分中的比例高達(dá)83.9％,遠(yuǎn)高于M1受體的14.7％。其它在去污劑不溶的部分中的比例為:PLCβ419.7％,PLCβ118.6％,Ga34％,G1121.6％。在用5 mM MβCD處理1h后,B2受體在去污劑不溶的部分的含量降至原來(lái)的30％(P＜0.05,n=3)。
　　 4、M受體激動(dòng)劑OXO-M誘導(dǎo)的SCG神經(jīng)元M電流抑制的百分率在

13、給予MβCD前為82+6.3％,而在給予10 mM MβCD和5 mM MβCD分別為49±8.7％(與給MβCD前相比顯著減少,P＜0.01)和71±4.9％(與給MβCD前相比無(wú)顯著差別,P＞0.05);而緩激肽BK誘導(dǎo)的M電流抑制的百分率在給予MβCD前為77±7％,而在給予MβCD5 mM和10 mM MβCD后分別為32±8.5％(與給MβCD前相比顯著減少,P＜0.01)和37±8％(與給MβCD前相比顯著減少,P＜0.01

14、),表明BK誘導(dǎo)的M電流抑制對(duì)MβCD更敏感。
　　 5、5 mM MβCD處理SCG神經(jīng)元后明顯減弱BK誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣升高,給予MβCD前后BK誘發(fā)的細(xì)胞內(nèi)鈣的變化率分別為128.3±3.1％和107.4±3.0％(P＜0.01)。
　　 6、在SCG神經(jīng)元B2受體較之M1受體與caveolin-1有更多共定位現(xiàn)象。
　　 結(jié)論:
　　 1、大鼠頸上神經(jīng)節(jié)(SCG)組織細(xì)胞上存在脂筏微域,Ⅱ型緩激肽受體