MicroRNA-133b在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及調(diào)控.pdf

1、研究背景及目的:
　　食管癌(esophagealcancer，EC)是最常見消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率及死亡率分別位居所有惡性腫瘤中的第八位和第六位，主要病理類型分有鱗狀細(xì)胞癌（esophagealsquamouscellcarcinomaESCC）和腺癌(esophagealadenocarcinoma，EAC)兩大類，其中絕大部分為ESCC;我國(guó)是EC發(fā)病率和死亡率最高的國(guó)家之一，其發(fā)病率位居惡性腫瘤的第4位。由于EC明確診

2、斷時(shí)很多病例都處于局部晚期或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，同時(shí)治療上缺乏靶向性，因此，目前EC預(yù)后效果仍舊不佳，術(shù)后總的5年生存率僅10-20％。更好的闡明EC的生物學(xué)行為，了解其發(fā)病機(jī)制對(duì)發(fā)展高效、特異性強(qiáng)的診斷方法和治療策略及提高EC術(shù)后生存具有重要意義。
　　微小RNA(miRNA)是一種長(zhǎng)約21-25核苷酸的非編碼單鏈內(nèi)源性RNA分子，進(jìn)化上高度保守，主要通過轉(zhuǎn)錄后及翻譯水平負(fù)性調(diào)控基因表達(dá)，在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化增殖、細(xì)胞凋亡、激素分泌

3、和腫瘤形成等多個(gè)環(huán)節(jié)中起著重要的作用。近來，越來越多研究證明，miRNA的生成及功能異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤發(fā)生過程中類似癌基因或抑癌基因。
　　研究證據(jù)提示miRNA參與了食管癌的發(fā)生、發(fā)展等病理過程，但具體作用機(jī)制仍舊未完全闡述清楚。因此，進(jìn)一步研究食管癌中miRNA表達(dá)譜及對(duì)異常表達(dá)miRNAs進(jìn)行功能分析有助于揭示食管癌發(fā)病新機(jī)制，同時(shí)為食管癌早期診斷、預(yù)后判斷及新的治療策略提供思路。
　　本課

4、題從研究食管鱗癌miRNAs表達(dá)譜著手，分析異常表達(dá)的miRNA在食管鱗癌中可能的作用機(jī)制。研究首先擬采用生物基因芯片分析并比較食管鱗狀細(xì)胞癌與正常食管鱗狀上皮粘膜miRNAs表達(dá)譜差異，篩選并驗(yàn)證食管鱗狀細(xì)胞癌中相關(guān)特異的、異常表達(dá)的miRNAs，并確定其靶基因;進(jìn)而，研究食管鱗癌異常表達(dá)的miRNAs及其靶基因在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制、以及可能的治療潛力。本課題研究提示了異常表達(dá)的miRNAs在食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中扮演

5、了重要角色，也為食管鱗狀細(xì)胞癌早期診斷和預(yù)后判斷及靶向治療提供理論據(jù)。
　　第一部分食管鱗狀細(xì)胞癌中特異miRNAs鑒定
　　目的:
　　分析比較食管鱗狀細(xì)胞癌中miRNAs表達(dá)譜，篩選并驗(yàn)證食管鱗癌相關(guān)、特異性的miRNAs。
　　方法:
　　利用TaqManMicroRNAArray生物芯片檢測(cè)并比較13對(duì)食管鱗癌及癌旁正常粘膜組織標(biāo)本的miRNAs表達(dá)譜，篩選出ESCC中異常表達(dá)的miRNAs;通過分

6、析比較并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，從31個(gè)候選miRNAs中選定了10個(gè)進(jìn)行初步分析，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-timequantitativePCR)方法在20配對(duì)ESCC及癌旁組織標(biāo)本中初步驗(yàn)證了miR-21，miR-135b，miR-133b等3個(gè)表達(dá)異常的miRNAs;在50對(duì)ESCC及癌旁組織標(biāo)本中進(jìn)一步驗(yàn)證上述3個(gè)異常癌表達(dá)miRNAs的表達(dá)水平，確認(rèn)與ESCC組織相關(guān)特異的miRNAs。
　　結(jié)果:
　　1，通過生物芯

7、片，發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織中31個(gè)miRNAs表達(dá)異常。
　　2，利用qRT-PCR技術(shù)，在配對(duì)大樣本食管鱗癌和癌旁正常粘膜組織篩選并驗(yàn)證，確定miR-21，miR-135b，miR-133b是ESCC相關(guān)的miRNAs。
　　結(jié)論:
　　miR-21,miR-135b，miR-133b是ESCC相關(guān)、特異的miRNAs。
　　第二部分miRNA-133b靶基因的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證
　　目的:
　　預(yù)測(cè)并確認(rèn)miR

8、-133b下游靶基因。
　　方法:
　　運(yùn)用生物信息學(xué)方法并結(jié)合文獻(xiàn)分析，從MiRbase、Targetscans及PicTar等靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)信息庫(kù)中預(yù)測(cè)，篩選出與腫瘤密切相關(guān)的基因作為miR-133b在ESCC中候選靶基因;然后，在40對(duì)配對(duì)ESCC及癌旁正常粘膜組織中，運(yùn)用qRT-PCR、蛋白印記法(WesternBlot)及免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，IHC)等方法檢測(cè)候選基因的表達(dá)水平，

9、運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)miR-133b表達(dá)水平，并比較miR-133b與候選基因表達(dá)水平的相關(guān)性，確定miR-133b下游靶基因。
　　結(jié)果:
　　1，通過miRNAs數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)并結(jié)合文獻(xiàn)分析，預(yù)測(cè)LASP1、CDKN2AIP及BCL2L2可能是miR-133b的靶基因;
　　2，運(yùn)用qRT-PCR、WestemBlot方法分析3個(gè)候選靶基因與miR-133b的關(guān)系，在ESCC組織中，我們發(fā)現(xiàn)miR-133b表達(dá)水平下

10、調(diào)，而LASP1在mRNA及蛋白水平表達(dá)均上調(diào)，兩者表達(dá)水平呈明顯的負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)=-0.499，p=0.011）;而其他兩個(gè)基因與miR-133b表達(dá)水平無相關(guān)性;免疫組化揭示LASP1在食管鱗癌組織的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中均有表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　LASP1為miR-133b的下游靶基因。
　　第三部分miRNA-133b及LASP1在食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病中作用機(jī)制探討
　　目的:
　　揭示miR-133b

11、及LASP1在食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中可能作用機(jī)制。
　　方法:
　　體外培養(yǎng)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株ECA109、KYSE510，運(yùn)用基因獲得和/或缺失功能研究(gain/loss-of-function)技術(shù)，瞬時(shí)傳染miR-133b-mimic及siRNA-LASP1后，運(yùn)用qRT-PCR方法檢測(cè)miR-133b表達(dá)水平變化，運(yùn)用qRT-PCR、WesternBlot等方法LASP1的表達(dá)水平變化;同時(shí)運(yùn)用MTTassa

12、y方法檢測(cè)細(xì)胞增殖;AnnexinV-FITCassay方法檢查對(duì)細(xì)胞凋亡的影響;Millcell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力和遷移能力。
　　結(jié)果:
　　1，在ECA10、KYSE510細(xì)胞中，miR-133b-mimic轉(zhuǎn)染72小時(shí)后miR-133b表達(dá)水平明顯上調(diào)(p=0.000，p=0.024);而LASP1的mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)(p=0.017，p=0.006)。
　　2，在ECA10、KYSE510細(xì)胞中，si

13、R-LASP1轉(zhuǎn)染72小時(shí)后miR-133b表達(dá)水平無明顯變化，而LASP1的mRNA(p=0.006，p=0.039)及蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)(p=0.003，p=0.001)。
　　3，MTTassay方法檢測(cè)細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)染miR-133b-mimic或siR-LASP1后72小時(shí)，ECA109、KYSE510細(xì)胞株增殖能力下降最明顯;聯(lián)合miR-133b-mimic和siR-LASP1轉(zhuǎn)染后ECA109、KYSE510細(xì)胞株

14、增殖能力較單一轉(zhuǎn)染miR-133b-mimic或siR-LASP1下降更明顯(p=0.000，p=0.002;p=0.007，p=0.027)。4，Millcell侵襲實(shí)驗(yàn)中，ECA109及KYSE510細(xì)胞株轉(zhuǎn)染miR-133b-mimic或siR-LASP1后18小時(shí)，侵襲能力較對(duì)照組明顯下降(p=0.001，p=0.000;p=0.001，p=0.000)。
　　5，Millcell遷移實(shí)驗(yàn)中，ECA109及KYSE510細(xì)