基因疊加和MIGS技術(shù)在水稻淀粉途徑中的應(yīng)用.pdf

1、水稻是世界三大糧食作物之一，全球超過(guò)半數(shù)的人以稻米為主糧。通過(guò)提高水稻單產(chǎn)、改善稻米品質(zhì)，滿足人類在生產(chǎn)生活等方面的多樣化需求具有極大的應(yīng)用價(jià)值，水稻種子內(nèi)淀粉的貯存含量對(duì)于水稻的產(chǎn)量有重要作用。淀粉的合成通常是由多種酶參與反應(yīng)完成，本研究通過(guò)應(yīng)用 miRNA誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(miRNA-induced gene silencing, MIGS)和基因疊加技術(shù)(gene stacking, GS)兩種不同的基因功能研究方法調(diào)控淀粉合成

2、途徑中關(guān)鍵基因表達(dá)，以期從淀粉組成、淀粉產(chǎn)量?jī)煞矫鎭?lái)實(shí)現(xiàn)水稻產(chǎn)量和品質(zhì)改良，主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　1、基于前期建立的適用于單子葉植物的高效MIGS基因沉默體系，我們構(gòu)建了定向沉默水稻顆粒結(jié)合淀粉合成酶基因(GBSSI)的 MIGS-OsGBSSI單基因載體。通過(guò)半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到OsGBSSI基因在轉(zhuǎn)錄水平被抑制表達(dá)；對(duì)胚乳進(jìn)行碘染色實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，野生型呈藍(lán)黑色，轉(zhuǎn)基因胚乳呈紅棕色，顏色與糯米染色結(jié)果較為接近；此

3、外，在掃描電鏡的觀察下，轉(zhuǎn)基因胚乳淀粉顆粒為圓形且排列致密，與野生型在形貌上存在一定的區(qū)別；利用雙波長(zhǎng)法測(cè)定直鏈淀粉含量得知，T1代胚乳中直鏈淀粉含量從24.53％下降到16.38%，下調(diào)效率達(dá)33.2%，與野生型中直鏈淀粉含量存在極顯著性差異，成功實(shí)現(xiàn)了 MIGS技術(shù)在淀粉合成途徑中的應(yīng)用。
　　2、對(duì)于 GS的多基因共表達(dá)體系，我們選取了水稻淀粉合成的重要基因OsAGPL2(pZHY973)、OsAGPS2b(pZHY975)

4、，分別構(gòu)建了兩個(gè)單基因過(guò)表達(dá)載體以及一個(gè)雙基因疊加載體(pZHY976)。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，灌漿期20-25DPA的水稻胚乳中OsAGPL2或OsAGPS2b在轉(zhuǎn)錄水平都高于野生型，但略低于雙基因疊加載體中的單個(gè)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平；半定量 RT-PCR對(duì)水稻進(jìn)行組織表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，葉片、胚乳中均能檢測(cè)到OsAGPL2、OsAGPS2b基因的表達(dá)，OsAGPL2在根中沒有表達(dá)；此外，通過(guò)蒽酮硫酸法測(cè)定水稻胚乳可溶性糖、總淀粉含量，結(jié)果表