活性氮介質(zhì)參與大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后學(xué)習(xí)記憶障礙及其電壓門控離子通道損傷機制.pdf

1、研究背景：
　　 癲癇是一組由不同病因引起的慢性腦部疾病，以大腦神經(jīng)元過度放電所致的短暫中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征。我國有約650萬癲癇患者，癲癇已被列為神經(jīng)科第二位最常見病。癲癇的發(fā)作與海馬等邊緣系統(tǒng)的病變密切相關(guān)，而海馬等腦組織的變化又參與了學(xué)習(xí)記憶等功能的形成。由于癲癇持續(xù)狀態(tài)（SE）或長期反復(fù)發(fā)作（SRS）引起相關(guān)腦組織損害而導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙嚴重危害人類健康，不僅使患者本人生活質(zhì)量下降，也給社會和家庭造成了沉重的負擔(dān)。

2、癲癇引起的認知功能障礙逐漸受到了神經(jīng)科學(xué)工作者的重視，對其致病機理與防治方法的研究是近年來關(guān)注的熱點。
　　 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來在病理生理等方面對癲癇進行了大量研究，并取得豐碩的成果。因為大腦需要消耗更多的氧、能量、葡萄糖，并且抗氧化能力較弱，所以大腦對氧化應(yīng)激非常敏感，海馬組織的氧化應(yīng)激可能抑制神經(jīng)可塑性和神經(jīng)活動的發(fā)生。
　　 活性氧（ROS）和活性氮（RNS）造成的氧化損傷稱為氧化應(yīng)激。一氧化氮（NO）作為

3、一種自由基，可產(chǎn)生氧化損傷而在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮毒性作用。NO可與超氧陰離子結(jié)合生成過氧亞硝酸陰離子（ONOO-），ONOO-是較NO及超氧陰離子氧化作用更強，作用更廣的氧化劑。NO大部分的神經(jīng)毒性作用由ONOO-介導(dǎo)。
　　 癲癇發(fā)作導(dǎo)致RNS大量產(chǎn)生和堆積，作用于電壓門控鉀（Kv）通道和電壓門控鈉（Nav）通道，影響通道電流和神經(jīng)元興奮性，成為癲癇發(fā)作后學(xué)習(xí)記憶障礙的機制之一。海馬神經(jīng)元上的Kv通道和Nav通道在調(diào)節(jié)神經(jīng)元興

4、奮性中發(fā)揮重要作用。RNS可通過cGMP、PKA、PKC信號通路調(diào)節(jié)通道蛋白功能并可通過硝化巰基蛋白等途徑調(diào)節(jié)Kv通道。
　　 目的：
　　 本實驗通過皮下注射皮羅卡品建立大鼠SE模型，利用神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）抑制劑7-NI、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）抑制劑AG闡明各種來源的NO及其衍生物ONOO-在癲癇學(xué)習(xí)記憶障礙過程中的具體作用。通過腦片膜片鉗技術(shù)檢測腦片Kv和Nav電流的變化及RNS對Kv和Nav電

5、流的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。進一步闡明RNS的作用位點及其機制。
　　 材料與方法
　　 動物實驗部分：雄性Wistar大鼠皮下注射皮羅卡品建立SE模型。實驗動物分為四組：SE組、對照組、7-NI（nNOS選擇性抑制劑）組、AG（iNOS選擇性抑制劑）組，SE組又分為6h、24h、3d、7d、14d組。用Moriss水迷宮系統(tǒng)檢測實驗動物空間學(xué)習(xí)記憶能力?；瘜W(xué)試劑盒檢測大鼠海馬氧化損傷物質(zhì)MDA含量，抗氧化酶GSH-Px、

6、SOD活性：NO含量、cNOS、iNOS活性。免疫組化檢測ONOO-含量，Western-blot檢測nNOS含量。尼氏（nissel）染色檢測大鼠海馬區(qū)形態(tài)。
　　 膜片鉗部分：ONOO-供體SIN-1作用于出生后14-18天的雄性Wistar大鼠腦片。在電流鉗模式下記錄ONOO-對電壓延遲整流鉀電流（IK）和瞬時外向鉀電流（IA）和電壓門控鈉通道電流（INa）的影響。在電壓鉗模式下記錄ONOO-對海馬神經(jīng)元動作電位（AP）和

7、AP發(fā)放頻率的影響。應(yīng)用PKC激動劑PDBu和抑制劑Chelerythrine，腺苷酸環(huán)化酶（AC）抑制劑MDL-12，330A，鳥苷酸環(huán)化酶（CG）抑制劑ODQ和亞硝化抑制劑NEM為工具藥，探討ONOO-對海馬神經(jīng)元電壓門控通道作用的信號途徑。
　　 實驗結(jié)果用平均數(shù)±標準誤（Mean±S.E.M）表示，兩組間數(shù)據(jù)比較用t-檢驗或t’-檢驗，多重組間比較用ANOVA檢驗，組間比較用Turkey's檢驗，當(dāng)P<0.05時認為結(jié)果

8、有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 動物實驗部分：NO含量在SE發(fā)作6h后即升高，在24h恢復(fù)正常，在3d和7d升高。結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶（cNOS）僅在SE發(fā)作6h升高，iNOS在3d、7d升高。Western-blot顯示nNOS含量僅在SE發(fā)作6h升高。氧化損傷物質(zhì)丙二醛（MDA）在6h升高，持續(xù)到7d。抗氧化酶超氧物岐化酶（SOD）僅在6h和3d升高，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）在3d、7d和14d升高。7-

9、NI可以降低MDA含量，7-NI和AG對SOD的活性均無影響。7-NI可使GSH-Px活性升高。Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示SE大鼠在探索實驗階段逃避潛伏期延長，7-NI可顯著降低SE大鼠的逃避潛伏期，AG對此無影響。探索實驗結(jié)果顯示SE鼠在原平臺象限停留時間明顯縮短，7-NI可提高SE大鼠在原平臺象限停留時間，AG對此無影響。
　　 膜片鉗實驗部分：
　　 1 SIN-1對AP的影響：SIN-1可增大動作電位時程（A

10、PD）并減少AP發(fā)放頻率和幅值，洗脫后SIN-1對AP的影響可恢復(fù)。
　　 2 SIN-1對電壓門控離子通道動力學(xué)的影響：SIN-1可抑制IK、IA和INa電流，并呈現(xiàn)濃度依賴性。SIN-1可使Ik的I-V曲線降低，Ik的半數(shù)激活電壓Vh由44.9±3.4 mV變?yōu)?9.2±8.3 mV，（n=6，P<0.05），k值分別為23.2±3.4和33.0±4.5（n=6，P<0.05）。說明ONOO-使Ik的激活曲線左移并改變其斜率

11、因子。給藥前后IA的半數(shù)激活電壓Vh分別是-1.18±0.98mV和-8.28±2.25 mV，（n=6，P<0.05），k分別是19.89±1.56和18.49±1.94（n=6，P>0.05），SIN-1可使IA的激活曲線向超極化方向移動，但不改變其斜率因子。SIN-1加藥前后IA的失活動力學(xué)Vh分別為-37.25±3.95 mV和-35.99+5.95 mV（n=6，P>0.05），k值分別為6.08±0.98和7.80±2.55

12、（n=6，P>0.05 vs.control），說明SIN-1對IA的失活動力學(xué)無影響。SIN-1使IA的失活后恢復(fù)的時間常數(shù)τ值由55.85±1.36 ms變?yōu)?9.25±7.11 ms（n=6，P<0.05）。
　　 經(jīng)擬合得出SIN-1給藥前后INa的Vh分別為-44.4±4.29 mV和-40.5.2±7.8mV，（n=6，P>0.05），k值分別為0.25±0.07和1.14±1.39（n=6，P>0.05）。說明ON

13、OO-對INa的激活過程無影響。由此計算出SIN-1給藥前后INa的Vh分別為（-45.7±1.93）mV和（-45.9±4.00）mV（n=6，P>0.05），k分別為3.05±1.44和3.99±1.56（n=6，P>0.05）。說明ONOO-對INa失活曲線無影響，也不改變其斜率因子。SIN-1作用前后τ分別為（2.92±0.49）ms和（4.66+1.45）ms（n=6，P<0.05），失活后最大P2峰電流可再恢復(fù)至P1峰電流的

14、90％以上。說明ONOO-可抑制INa電流的失活后恢復(fù)過程。
　　 3 SIN-1作用于電壓門控離子通道的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
　　 應(yīng)用特異性的CG抑制劑ODQ對SIN-1誘導(dǎo)的IK電流的改變無影響（P>0.05）。以影響膜通透的PKC抑制劑chelerythrine（2.5μM）預(yù)處理腦片10min，可抑制SIN-1對Ik的作用。以上結(jié)果提示ONOO-可能通過PKC通路調(diào)節(jié)Ik電流。為了進一步驗證實驗結(jié)果，以PKC激動劑PD

15、Bu（6μM）預(yù)處理腦片，SIN-1對Ik的抑制作用增強（P<0.05，vs SIN-1 group）。另外，PDBu能模擬SIN-1對Ik電流的抑制作用（P<0.05，vs control group）。
　　 以影響膜通透的AC抑制劑MDL-12，330A（25μM）預(yù)處理腦片10min，可發(fā)現(xiàn)MDL-12，330A對SIN-1抑制INa的作用無影響。NEM（50μM，預(yù)處理10min）不影響SIN-1對INa的抑制作用。應(yīng)

16、用特異性的CG抑制劑ODQ可抑制SIN-1誘導(dǎo)的INa電流的改變（n=6，P<0.05 vsSIN-1）。
　　 結(jié)論：
　　 1 nNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO參與皮羅卡品誘導(dǎo)的SE發(fā)作后早期的學(xué)習(xí)記憶障礙的病理過程；
　　 2 SE發(fā)作后早期的學(xué)習(xí)記憶障礙與iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO無關(guān)；
　　 3 SE發(fā)作后ONOO-含量增加，可能與SE導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙有關(guān)；
　　 4 SIN-1可使IK的激活曲線左

17、移并改變其斜率因子，IA的激活曲線向超極化方向移動，并抑制IA和INa電流的失活后恢復(fù)過程。ONOO-的病理作用可能與其影響電壓門控離子通道動力學(xué)有關(guān)；
　　 5 SIN-1可增大APD和并減少AP發(fā)放頻率和幅值，從而影響神經(jīng)元興奮性，可能為ONOO-神經(jīng)毒性的機制之一：
　　 6 SIN-1可能通過PKC通路抑制IK，而與cGMP通路無關(guān)；
　　 7 SIN-1通過CG途徑抑制INa電流與PKA和蛋白巰基亞硝化