miR--24及其調(diào)節(jié)的Bc12111和SESN1在三氧化二砷促肝癌細(xì)胞凋亡過程作用的研究.pdf

1、目的:
　　原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，以手術(shù)為首選的肝癌綜合治療，已經(jīng)達(dá)成了共識(shí)。近些年來，研究和臨床試驗(yàn)證明了三氧化二砷(As2O3)對(duì)實(shí)體腫瘤具有抑制作用，特別是對(duì)肝癌等消化道腫瘤作用明顯。隨著對(duì)As2O3的作用機(jī)制的進(jìn)一步研究，研究者們發(fā)現(xiàn)，As2O3抗腫瘤的主要作用機(jī)制之一，在于其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　miRNA是一組調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的小片段、非編碼RNA分子，調(diào)節(jié)裂解mRNA或抑制翻譯過程，在腫瘤細(xì)胞

2、內(nèi)功能重要，在對(duì)肝癌miRNA的篩查中，發(fā)現(xiàn)miR-24和miR-27a表現(xiàn)出差異性表達(dá)。在對(duì)As2O3處理后的肝癌HepG2細(xì)胞系，進(jìn)行Microarray的Mima的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-24，miR29a等出現(xiàn)兩倍以上的上調(diào)改變。表明miR-24可能在As2O3的抗腫瘤機(jī)制中起到一定作用，其與促凋亡可能存在聯(lián)系。
　　bcl-2l11即Bcl-2相互作用細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)蛋白(Bim)，bcl-2l11誘導(dǎo)AKT磷酸化可能是As2O3

3、誘導(dǎo)凋亡發(fā)生的核心元素;Sestrin1是p53特定的靶基因，Sestrin1蛋白通過激活A(yù)MP敏感蛋白激酶(AMPK)，從而抑制mTOR(mTOR可正向調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng))，調(diào)控凋亡。通過Targetscan等預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)后，我們發(fā)現(xiàn)miR-24的目的基因高度可能為bcl-2l11和或Sestrin1基因，根據(jù)以上研究，推斷bcl-2l11和或Sestrin1基因及產(chǎn)物，可能在As2O3對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞系的凋亡作用中起到重要作用。As2

4、O3對(duì)于肝癌的治療是否干擾miR-24，miR-24是否調(diào)節(jié)bcl-2l11和或Sestrin1基因及其產(chǎn)物，最終誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡，有待研究。
　　本次研究將通過不同濃度As2O3處理肝癌細(xì)胞系，觀察As2O3對(duì)肝癌細(xì)胞系的作用，檢驗(yàn)miR-24發(fā)生何種程度的改變及bcl-2l11和Sestrin1是否發(fā)生改變;再通過構(gòu)建過表達(dá)的miR-24的細(xì)胞系，觀察肝癌細(xì)胞系的增值及凋亡能力，檢測(cè)bcl-2l11和Sestrin1是否發(fā)生改變

5、。通過以上實(shí)驗(yàn)及結(jié)果，進(jìn)一步探討，As2O3對(duì)肝癌細(xì)胞系的作用機(jī)制，以及miR-24在肝癌發(fā)生發(fā)展及治療過程中的作用，miR-24對(duì)bcl-2l11和Sestrin1是否起到調(diào)節(jié)作用而誘導(dǎo)凋亡抑制腫瘤。
　　方法:
　　分別使用2μmol/LAs2O3和4μmol/LAs2O3處理HepG2和Huh7肝癌細(xì)胞系，通過MTT、流式細(xì)胞術(shù)等細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察，對(duì)比空白對(duì)照組不同濃度As2O3處理的肝癌細(xì)胞系，的增值及凋亡能力，同

6、時(shí)采用RT-PCR技術(shù)檢驗(yàn)miR-24發(fā)生何種程度的改變，應(yīng)用western-blot技術(shù)檢測(cè)bcl-2l11和Sestrin1是否發(fā)生改變;再根據(jù)miR-24成熟體hsa-miR-24序列化學(xué)合成miR24模擬物hsa-miR-24-mimics，脂質(zhì)體介導(dǎo)mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株，構(gòu)建過表達(dá)的mir-24的細(xì)胞系，RT-PCR檢測(cè)確定轉(zhuǎn)染有效后，通過MTT、流式細(xì)胞術(shù)等細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察，對(duì)比空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組和mimics

7、-NC轉(zhuǎn)染組，肝癌細(xì)胞系的增值及凋亡能力，應(yīng)用western-blot技術(shù)檢測(cè)bcl-2l11和Sestrin1是否發(fā)生改變。通過熒光素酶酶報(bào)告系統(tǒng)法觀察miR-24對(duì)bcl-2l11和Sestrin1是否起到調(diào)節(jié)作用。與通過以上實(shí)驗(yàn)及結(jié)果，進(jìn)一步探討，As2O3對(duì)肝癌細(xì)胞系的作用機(jī)制，以及miR-24在肝癌發(fā)生發(fā)展及治療過程中的作用，miR-24對(duì)bcl-2l11和Sestrin1是否起到調(diào)節(jié)作用而誘到凋亡抑制腫瘤。
　　結(jié)果:

8、
　　2μmol/LAs2O3和4μmol/LAs2O3處理HepG2和Huh7肝癌細(xì)胞系，對(duì)比空白對(duì)照組，細(xì)胞增值受到抑制及凋亡明顯，miR-24表達(dá)相比空白對(duì)照組明顯增高，bcl-2l11和Sestrin1表達(dá)對(duì)比空白對(duì)照組也明顯增高。成功構(gòu)建過表達(dá)的miR-24的細(xì)胞系，對(duì)比空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組和mimics-NC轉(zhuǎn)染組，肝癌細(xì)胞系的增值能力下降及凋亡能力增強(qiáng)，bci-2l11和Sestrin1的表達(dá)，前三組無明顯改變，轉(zhuǎn)染

9、細(xì)胞株表達(dá)過表達(dá)。熒光素酶酶報(bào)告系統(tǒng)法檢測(cè)提示miR-24對(duì)bcl-2l11和Sestrin1起到調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)論:
　　1、As2O3對(duì)肝癌細(xì)胞系的作用，具有促凋亡，抑制細(xì)胞增殖的影響，具有一定得濃度依賴性。
　　2、As2O3對(duì)肝癌細(xì)胞系促凋亡作用中，miR-24過表達(dá)，bcl-2l11和Sestrin1過表達(dá)。
　　3、篩選并建立過表達(dá)的miR-24基因的肝癌細(xì)胞株。應(yīng)用體外細(xì)胞生物學(xué)研究方法，miR-