里氏木霉內(nèi)切葡萄糖苷酶EGI在畢赤酵母中的克隆表達(dá)和優(yōu)化.pdf

1、纖維素是自然界中存在最廣泛的一類碳水化合物，同時(shí)它也是地球上數(shù)量最大的可再生資源。目前，自然界中纖維素只有一小部分得到了利用，絕大多數(shù)纖維素不僅被白白浪費(fèi)，而且對(duì)環(huán)境造成了污染。利用微生物生產(chǎn)的纖維素酶將其轉(zhuǎn)化為人類急需的能源、食物和化工原料，對(duì)于人類社會(huì)解決環(huán)境污染、食物短缺和能源危機(jī)具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。將里氏木霉纖維素酶內(nèi)切葡萄糖苷酶基因，用基因工程方法高效分泌表達(dá)，并研究其酶學(xué)性質(zhì)，為改進(jìn)酶學(xué)活性提供研究參數(shù)，奠定基礎(chǔ)。
　

2、　 目前纖維素的研究已經(jīng)日趨成熟，但對(duì)于里氏木霉內(nèi)切葡萄糖苷酶的純化和酶學(xué)性質(zhì)的研究甚少。本文成功的克隆了里氏木霉內(nèi)切葡萄糖苷酶EGI基因，將其連接到pPIC9K載體，構(gòu)建了分泌表達(dá)型畢赤酵母質(zhì)粒pPIC9K-egl，并把它整合到了畢赤酵母基因組中，利用甲醇對(duì)陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了較為系統(tǒng)的誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化，確立了最佳表達(dá)條件為：30℃下，誘導(dǎo)劑濃度為2％，接種量為OD6002.5，氮源為1.0％的蛋白胨，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，起始培養(yǎng)基

3、PH為6.0時(shí)酶的活性最高，最大酶活出現(xiàn)在甲醇誘導(dǎo)表達(dá)48 h-60h之間。
　　 在搖瓶?jī)?yōu)化條件的基礎(chǔ)上，對(duì)畢赤酵母重組子GS115/egl進(jìn)行了5L發(fā)酵罐的高密度培養(yǎng)。將發(fā)酵上清超濾濃縮后，采用離子交換的方法進(jìn)行分離純化，制備純酶，并測(cè)定其活性和酶學(xué)性質(zhì)。純化后的酶活性為0.892U/mL，比酶活為11.952U/mg，比未純化前提高了1.82倍。經(jīng)過酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果顯示，重組EGI催化反應(yīng)酶活力的最適溫度為50℃，最適pH