補腎滋陰方藥對實驗性糖尿病腎病大鼠治療作用及機制的研究.pdf

1、目的：糖尿病腎病是糖尿病常見而難治的微血管并發(fā)癥，已成為糖尿病患者的主要死因之一。其發(fā)病機制主要與高血糖、腎臟血流動力學異常、家族遺傳性等有關(guān)。 腎素-血管緊張素系統(tǒng)在糖尿病腎病發(fā)病機制中占有重要地位，血管緊張素Ⅱ不僅是一種血管活性因子，影響腎臟血流動力學，還是一種生長因子及促纖維化因子，影響腎臟固有細胞的生物學功能。轉(zhuǎn)化生長因子-β1。在糖尿病腎病相關(guān)的生長因子網(wǎng)絡(luò)中處于中心地位，可通過多種機制促進腎小球肥大、刺激細胞外基質(zhì)合

2、，參與腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生。 糖尿病腎病與中醫(yī)“消渴”之“下消”關(guān)系密切，“腎陰虧虛”在其發(fā)生發(fā)展的過程中具有重要作用，也是早期糖尿病腎病(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期)的基本病機之一，補腎滋陰方藥常用于早期糖尿病腎病治療。六味地黃丸是補腎滋陰的經(jīng)典方劑，很多臨床研究均證實其對糖尿病腎病具有良好的治療作用，但其作用機制尚不清楚。本實驗采用腹腔注射鏈尿佐菌素的方法先復制大鼠糖尿病模型，進而發(fā)展為糖尿病腎病，觀察六味地黃湯對其血糖、腎

3、功能、24小時尿蛋白定量、腎組織病理形態(tài)學及腎組織腎素活性、血管緊張素Ⅱ和轉(zhuǎn)化生長因子-β1表達的影響，初步探討本方的作用機理，為臨床應用補腎滋陰方藥治療早期糖尿病腎病提供實驗依據(jù)。第一部分六味地黃湯對糖尿病腎病大鼠腎功能及腎組織病理形態(tài)學的影響方法：選用清潔級雄性健康SD大鼠30只體重200±10g，普通飼料適應性喂養(yǎng)一周，隨機抽6只為正常組(NC)，其余大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)60 mg/kg，正常組注射相應量生理鹽水

4、，72小時后，測血糖以≥16.65mmol/L，尿糖陽性為DM模型成模標準。成模大鼠被隨機分為：模型組(DM)、苯那普利組(BN)、六味地黃湯(LD)組，成模后一周按成人劑量的20倍給藥，每日一次。六味地黃湯組按25g/kg予六味地黃湯，苯那普利組按6.67mg/kg灌胃，各組共給藥8周；正常組和模型組均灌服相應量的生理鹽水。于DM成模后第9周末禁食不禁水留取各組大鼠24小時尿液檢測24小時尿蛋白定量、尿肌酐(Ucr)；各組大鼠禁食8小

5、時，稱重，麻醉動物，股動脈取血，分離血清，檢測空腹血糖(FPG)，血尿素氮(BUN)，血肌酐(Scr)，計算肌酐清除率(Ccr)。無菌操作取雙腎，剝離被膜稱重，計算腎重/體重指數(shù)(KW/BW)；取右腎組織4％多聚甲醛初步固定，用于觀察腎臟病理形態(tài)學變化；血、尿生化指標均用全自動生化分析儀測定。 結(jié)果：1 一般情況及空腹血糖、腎重/體重指數(shù)、24h尿蛋白定量：大鼠注射STZ后體重增長緩慢，毛色差，實驗結(jié)束時，出現(xiàn)腎臟體積增大，尿蛋

6、白增多；空腹血糖模型組與正常組比較明顯增高(P<0.01)，苯那普利組空腹血糖與模型組比較無明顯變化；六味地黃湯組與模型組比較明顯降低(P<0.05)；24h尿蛋白定量模型組與正常組比較明顯升高(P<0.01)，苯那普利組、六味地黃湯組與模型組比較明顯降低(P<0.05)，六味地黃湯組與苯那普利組比較明顯降低(P<0.05)；腎重/體重指數(shù)模型組與正常組比較明顯增高(P<0.01)，六味地黃湯組、苯那普利組與模型組比較均有顯著降低(P<

7、0.05)，其中六味地黃湯組優(yōu)于苯那普利組但無顯著性差異。 2 血尿素氮、肌酐清除率的測定結(jié)果：血尿素氮模型組與正常組比較明顯增高(P<0.01)，苯那普利組與模型組比較均有明顯降低(P<0.05)，六味地黃湯組與苯那普利組比較明顯降低(P<0.01)，仍高于正常組但無顯著差異；肌酐清除率模型組與正常組比較有顯著性增高(P<0.01)，苯那普利組、六味地黃湯組與模型組比較均有顯著性降低(P<0.05)，六味地黃湯組優(yōu)于苯那普利組但無顯著

8、性差異。 3.腎組織病理形態(tài)學觀察：HE、PAS染色光鏡下可見正常組腎小球結(jié)構(gòu)完整，未見腎小球肥大，腎小球毛細血管基底膜、系膜、基質(zhì)未見明顯異常改變；模型組腎小球系膜區(qū)彌漫性增寬，系膜細胞輕、中度增生，腎小球基底膜增厚，PAS染色物質(zhì)明顯增多，部分毛細血管受壓塌陷等表現(xiàn)。苯那普利組、六味地黃湯組的腎小球結(jié)構(gòu)也有類似的病理改變，但明顯較模型組減輕(P<0.05)。 第二部分六味地黃湯對糖尿病腎病大鼠腎組織腎素-血管緊張素系

9、統(tǒng)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1的影響方法：動物分組、造模方法和給藥方法同第一部分，用放射免疫法測定腎組織勻漿腎素活性和血管緊張素II水平，結(jié)果用腎組織總蛋白校正，計算出腎組織每克蛋白中的腎素活性和血管緊張素Ⅱ含量。TGF-β1蛋白表達采用免疫組織化學PV法檢測，病理圖像分析系統(tǒng)測積分光密度和相對陽性面積。結(jié)果：1 腎組織腎素活性和血管緊張素Ⅱ含量：腎素活性模型組顯著高于正常組(P<0.05)，苯那普利組比模型組顯著增高(P<0.05)，六味地黃

10、湯組顯著低于苯那普利組(P<0.05)，六味地黃湯組略低于模型組但無明顯差異。血管緊張素Ⅱ含量，模型組與正常組比較有顯著增加(P<0.01)；苯那普利組與模型組比較顯著降低(P<0.05)，六味地黃湯組低于苯那普利組但無顯著性差異。2腎組織TGF-β1的表達：光鏡下觀察，模型組TGF-β1表達主要表達于腎小球系膜區(qū)，腎小管上皮細胞也有不同程度表達，陽性顆粒主要位于胞漿中。病理圖象半定量分析：模型組腎小球TGF-β1表達的相對面積及積分光

11、密度均明顯高于正常組(P<0.01)；苯那普利組、六味地黃湯組均明顯低于模型組(P<0.05)；六味地黃湯組低于苯那普利組但無顯著性差異。 結(jié)論： 1.補腎滋陰之六味地黃湯具有改善DN大鼠一般狀態(tài)，降低血糖、BUN和Ccr，改善腎功能，對早期DN有確切的療效。 2.補腎滋陰之六味地黃湯具有減少DN大鼠尿蛋白的排出，抑制早期腎臟肥大，減輕腎臟病理損害和延緩腎臟病理進展的作用。 3.補腎滋陰之六味地黃湯對DN