胰液中HHIP基因甲基化狀態(tài)檢測及其在胰腺疾病診斷中的應用研究.pdf

1、胰腺癌是一種惡性程度高，進展迅速，手術(shù)切除率低，預后極差的惡性腫瘤，5年生存率僅有5％。近年來胰腺癌的發(fā)病率有上升趨勢。世界上每年有胰腺癌新發(fā)病例約20萬人，占全部惡性腫瘤發(fā)病的2％，其死亡率與發(fā)病率十分接近，每年死亡人數(shù)約19.6萬人。在我國，隨著人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，胰腺癌的發(fā)病率也呈逐年增高趨勢。我國上海地區(qū)統(tǒng)計結(jié)果表明，1995年胰腺癌男、女患病率分別為9.6/萬及9.2/萬，較70年代相比，增加了7～8倍，已成為

2、我國常見的惡性腫瘤，因此，深入研究胰腺癌的分子發(fā)病機制顯得十分必要。 表觀遺傳學是指在不改變DNA序列的前提下對基因的表達進行調(diào)控。表觀基因組學則是在基因組水平上對表觀遺傳學改變的研究。表觀遺傳學包括DNA甲基化、組蛋白修飾(如乙?；?、甲基化)以及由非編碼RNA調(diào)控的mRNA表達等。DNA甲基化是一種主要的表觀遺傳學修飾方式。隨著研究的深入，人們越來越意識到DNA甲基化在哺乳動物發(fā)育及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，且在腫瘤的診

3、斷和治療方面均有廣闊的應用前景。 基于上述研究現(xiàn)狀，本課題利用甲基化特異性PCR等分子生物學技術(shù)，研究人音猬因子相互作用蛋白(HHIP)基因在胰腺癌低表達的分子機制，初步探討HHIP基因的功能。 一、胰液DNA的提取及DNA亞硫酸氫鹽處理方法的建立 目的：探索并建立適合胰液DNA的抽提方法及DNA亞硫酸氫鹽處理的方法，進而為下一步的分子生物學實驗提供可靠而穩(wěn)定的工作基礎(chǔ)。 方法：采用ERCP術(shù)中胰管插管法

4、收集純胰液，分別以傳統(tǒng)的酚-氯仿法和市售的DNA提取試劑盒法提取胰液DNA，通過凝膠電泳分析及紫外分光光度計法分析DNA純度和濃度。進而采用甲基化試劑盒進行亞硫酸氫鹽處理DNA，以甲基化特異性PCR(MSP)檢測基因甲基化狀態(tài)。 結(jié)果：市售的DNA提取試劑盒法提取的胰液DNA具有較好的純度和濃度，亞硫酸氫鹽試劑盒處理待測DNA具有穩(wěn)定性好、轉(zhuǎn)化完全的優(yōu)點。 結(jié)論：市售的DNA提取試劑盒法提取胰液DNA和亞硫酸氫鹽試劑盒處

5、理DNA是方便、可行的。 二、人胰腺癌細胞株HHIP基因甲基化狀態(tài)檢測和分析 目的：探討人胰腺癌細胞株HHIP表達與其甲基化的關(guān)系，以了解胰腺癌的發(fā)生機制。 方法：以人胰腺癌細胞株BxPC-3、CFPAC-1、PANC-1、AsPC-1和PaTu8988s為研究對象，以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法及免疫細胞化學染色法(SP法)檢測去甲基化制劑DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-C

6、dR)處理前后各胰腺癌細胞株HHIP mRNA及蛋白表達的變化，以甲基化特異性PCR(MSP)結(jié)合測序檢測HHIP基因CpG島甲基化狀態(tài)。 結(jié)果：5-Aza-CdR處理前，胰腺癌細胞株BxPC-3、CFPAC-1、PANC-1、AsPC-1和PaTu8988s無HHIP mRNA表達；經(jīng)5-Aza-CdR處理后，HHIP mRNA重新表達。MSP結(jié)合測序顯示上述胰腺癌細胞株HHIP基因CpG島存在高甲基化。 結(jié)論：人胰腺

7、癌細胞株HHIP表達抑制與其基因CpG島高甲基化相關(guān)。HHIP基因CpG島高甲基化可能在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起一定作用。 三、胰腺癌組織中HHIP基因CpG島甲基化分析 目的：研究胰腺癌組織(Pancreatic cancer tissue，PCa)中人音猬因子相互作用蛋白(Human Hedgehog interacting Protein，HHIP)基因CpG島甲基化狀態(tài)，探索胰腺癌早期診斷的檢測方法。 方法

8、：采用巢式甲基化特異性聚合酶鏈反應(nested methylation specific PCR，NMSP)和基因克隆測序的方法檢測30例胰腺癌及其癌旁組織(cancer-adjacent tissue，CAT)和13例慢性胰腺炎(chronic pancreatitis tissue，CP)組織中HHIP基因CpG島甲基化狀況，分析其檢測結(jié)果。 結(jié)果：NMSP結(jié)果顯示HHIP在胰腺癌組織、胰腺癌旁組織、慢性胰腺炎組織、中甲基

9、化陽性率分別為43.3％(13/30)、0％(0/30)和7.7％(1/13)，胰腺癌組織的甲基化陽性率顯著高于慢性胰腺炎和癌旁胰腺組織的甲基化陽性率(P＜0.05)。測序結(jié)果證實胰腺癌組織中多個CG位點發(fā)生甲基化，而大部分慢性胰腺炎組織及胰腺癌癌旁組織中的CG位點未發(fā)生甲基化。 結(jié)論：在胰腺癌組織中HHIP基因CpG島呈現(xiàn)高甲基化的狀態(tài)，表明HHIP基因CpG島甲基化可能與胰腺癌的發(fā)生相關(guān)。 四、胰液中HHIP基因Cp

10、G島甲基化改變及意義 目的：探討純胰液(pure pancreatic juice，PPJ)中人音猬因子相互作用蛋白(HumanHedgehog interacting Protein，HHIP)基因CpG島甲基化檢測在胰腺癌診斷中的價值。 方法：2006～2008年82例來自長海醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心的行內(nèi)鏡逆行膽胰管造影(ERCP)患者，采用ERCP術(shù)中胰管插管法收集純胰液。通過巢式甲基化特異性聚合酶鏈反應(nested

11、methylation specific PCR，NMSP)和基因克隆測序的方法檢測31例胰腺癌(pancreatic carcinoma，PCa)、36例慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)及15例良性非胰腺疾病(non-pancreatic disease，NP)患者胰液中HHIP基因CpG島甲基化狀況，分析其檢測結(jié)果。 結(jié)果：NMSP結(jié)果顯示HHIP在胰腺癌、慢性胰腺炎及正常對照組胰液中甲基化陽性率

12、分別為54.8％(17/31)、2.7％(1/36)和6.7％(1/15)，胰腺癌組的甲基化陽性率顯著高于慢性胰腺炎組和正常對照組(P＜0.01)。測序結(jié)果證實胰腺癌組多個CG位點發(fā)生甲基化，而慢性胰腺炎組及正常對照組的CG位點未發(fā)生甲基化。 結(jié)論：ERCP術(shù)中收集的純胰液可用于分子生物學檢測，檢測胰液中HHIP基因甲基化改變有助于胰腺癌的診斷。通過上述研究，本課題得出以下結(jié)論： 1、HHIP基因CpG島高甲基化是導致其