潰瘍性結(jié)腸炎患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對自體樹突狀細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的: 研究潰瘍性結(jié)腸炎(UC)患者的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）對外周血自體樹突狀細(xì)胞（DCs）功能的影響，并探討其可能的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 1. hMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定：取3例UC患者骨髓，hMSCs分離液分離單個核細(xì)胞，含10％胎牛血清的低糖DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，取第4代細(xì)胞分別與異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鼠抗人CD29、CD34、CD45單克隆抗體孵育

2、，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）鑒定表型。成骨誘導(dǎo)體系誘導(dǎo)hMSCs定向分化，通過細(xì)胞形態(tài)觀察及免疫化學(xué)染色進(jìn)行鑒定。
　　 2. DCs誘導(dǎo)及鑒定：取3例UC患者外周血分別收獲單個核細(xì)胞， RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱孵育2小時后棄去非貼壁細(xì)胞，部分細(xì)胞第6天促其成熟，收獲培養(yǎng)第7天的DCs，分別與以FITC、藻紅素(PE)標(biāo)記的鼠抗人Cdla、CD83、CD 80、CD86、CD14單克隆抗體孵育，F(xiàn)CM

3、鑒定DCs免疫表型。
　　 3. hMSCs培養(yǎng)上清混合液對DCs表型的影響：收獲培養(yǎng)第5天的UC患者的DCs，分為單獨(dú)培養(yǎng)組（對照組）和混合培養(yǎng)組，混合培養(yǎng)組按hMSCs上清（2-4代hMSCs培養(yǎng)上清混合液）與RPMI-1640體積比不同分為1：5、1：15、1：45三組，對照組只加RPMI-1640培養(yǎng)基，72小時后收獲DC鑒定表型。
　　 4. IL-10，IL-12濃度測定：分別收集上述四組的DCs 24、48

4、、72小時的上清液，ELISA試劑盒測定其IL-10、 IL-12濃度，動態(tài)觀察兩種細(xì)胞因子的分泌量。
　　 5. DCs凋亡率檢測：收獲培養(yǎng)第5天的UC患者DCs，分為單獨(dú)培養(yǎng)組（對照組）和混合培養(yǎng)組，混合培養(yǎng)組按hMSCs上清（2-4代hMSCs培養(yǎng)上清混合液）與RPMI-1640體積比不同分為1：1、1：5、1：10、1：15、1：45五組，對照組只加RPMI-1640培養(yǎng)基，F(xiàn)CM檢測各組DCs凋亡率。
　　 結(jié)

5、果:
　　 1. hMSCs的鑒定：培養(yǎng)第4代hMSCs，F(xiàn)CM鑒定結(jié)果：高表達(dá)CD29，低表達(dá)CD34、CD45造血干細(xì)胞標(biāo)記；定向誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶活性。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 2. DCs的鑒定：培養(yǎng)第7天DCs低表達(dá)CD14， 高表達(dá)Cdla、CD86、CD 80、CD83。
　　 3. hMSCs上清作用后DCs免疫表型的變化：hMSCs上清液作用于DCs 72小時后，

6、hMSCs上清處理組的DCs表面標(biāo)記CD80 、CD86、CD83表達(dá)明顯降低，與對照組比較有顯著差異（P<0.01）。
　　 4. IL-10、 IL-12濃度測定：動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，兩種細(xì)胞因子在48小時分泌量最多，與對照組相比，hMSCs上清處理組IL-10分泌量顯著增多，而IL-12分泌明顯減少（P<0.01）
　　 5. DCs凋亡率檢測： hMSCs上清作用于DCs后，在1：1、1：5、1：10組部分DCs發(fā)生凋