胃飼乙醇預(yù)處理增強(qiáng)肝臟對(duì)缺血再灌注損傷耐受性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究的目的在于在以往研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討通過(guò)胃飼乙醇預(yù)處理能否延長(zhǎng)大鼠肝臟耐受入肝血流阻斷的安全時(shí)限。 以門(mén)靜脈轉(zhuǎn)流下的肝臟缺血再灌流模型為基礎(chǔ)，并采用前期實(shí)驗(yàn)已建立的胃飼乙醇預(yù)處理方法：術(shù)前24h給予大鼠胃飼40％乙醇5g/Kg。健康成年Wistar大鼠，雌雄不限，隨機(jī)分為：肝臟缺血手術(shù)組(IR)和胃飼乙醇預(yù)處理組(EPC)。胃飼40％乙醇5g/Kg24h后行肝臟缺血手術(shù)，肝門(mén)阻斷時(shí)間為120min。阻斷期間觀察肝臟缺血情

2、況、胃腸道淤血情況。觀察動(dòng)物存活時(shí)間為2周。如果20只大鼠中在觀察時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)1只以上死亡，則將缺血時(shí)間縮短至110min，繼續(xù)觀察存活情況，如動(dòng)物仍有死亡則將缺血時(shí)間繼續(xù)減少至100min；如果大鼠無(wú)死亡，則缺血時(shí)間可繼續(xù)延長(zhǎng)，直至動(dòng)物出現(xiàn)死亡。以動(dòng)物存活率為100％的入肝血流阻斷時(shí)間初步設(shè)定為最大安全時(shí)限。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),胃飼乙醇后，動(dòng)物中毒癥狀輕微，很快完全恢復(fù)；術(shù)中肝門(mén)阻斷后，胃腸道無(wú)明顯淤血;肝臟缺血120min后，EPC組

3、術(shù)后2周內(nèi)無(wú)動(dòng)物死亡，存活率為100％；IR組術(shù)后2周內(nèi)存活率為70％;阻斷肝臟血流時(shí)間延長(zhǎng)后，各組死亡數(shù)增高。肝臟缺血130min后，EPC組術(shù)后2周內(nèi)動(dòng)物存活率為80％，IR組術(shù)后2周內(nèi)存活率為60％;與EPC缺血120組相比，IR缺血120min組、EPC缺血130min及IR缺血130min組死亡率均明顯增高，差異具有顯著性意義(p＜0.01)。根據(jù)此結(jié)果，可將大鼠入肝血流阻斷的最大安全時(shí)限初步設(shè)定為120min，進(jìn)一步驗(yàn)證。

4、 實(shí)驗(yàn)提示，經(jīng)胃飼乙醇預(yù)處理后可能延長(zhǎng)大鼠肝臟對(duì)缺血耐受的最大安全時(shí)限至120min。 本實(shí)驗(yàn)以胃飼乙醇預(yù)處理模式為處理因素，探討其對(duì)120min缺血時(shí)肝臟的保護(hù)作用，以進(jìn)一步證明該預(yù)處理后大鼠肝臟耐受缺血的最大安全時(shí)限可延長(zhǎng)至120min。實(shí)驗(yàn)分為：正常對(duì)照組(N)、胃飼乙醇組(E組)、肝臟缺血手術(shù)組(IR組)、生理鹽水預(yù)處理組(NPC組)、胃飼乙醇預(yù)處理組(EPC組)和缺血預(yù)處理組(IPC組)。于再灌注0h、3h、6h

5、、12h、24h、72h及1w活殺動(dòng)物，留取下腔靜脈血以及右肝前葉組織，以存活率、肝功能、肝組織ATP含量、肝細(xì)胞凋亡及病理形態(tài)學(xué)為觀察指標(biāo)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),術(shù)中動(dòng)物麻醉平穩(wěn)，胃腸道未見(jiàn)明顯淤血。術(shù)后EPC組恢復(fù)平穩(wěn)順利，24h后能自由飲食及活動(dòng)；IPC組、NPC組及IR組在術(shù)后動(dòng)物全身狀況較差，36h后方能自由活動(dòng)。EPC組動(dòng)物術(shù)后1w內(nèi)存活率為100％，IPC組存活率為78％，IR組存活率為78％，NPC組存活率為83％，EPC

6、組與其余各手術(shù)組術(shù)后存活率相比差異顯著(p＜0.05);E組ALT于相應(yīng)各個(gè)檢測(cè)時(shí)相與正常組對(duì)照無(wú)顯著差異(p＞0.05)，各手術(shù)組于再灌流72h后ALT值與正常組相比無(wú)明顯差異(p＞0.05)，EPC組再灌流6h、24h顯著低于NPC組(p＜0.05)，再灌流0h、6h顯著低于IR組(p＜0.05)，與IPC組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05)，但各時(shí)相的ALT值均低于IPC組；NPC組與IR組再灌流后ALT變化規(guī)律相近，在各個(gè)時(shí)相無(wú)顯著

7、差異(P＞0.05);E組AST值于相應(yīng)各個(gè)檢測(cè)時(shí)相與正常組無(wú)顯著差異(p＞0.05)；各手術(shù)組AST值均顯著高于正常組(p＜0.01)，于再灌流72h后AST值與正常組相比無(wú)明顯差異(p＞0.05)；EPC組各時(shí)相的AST值與IR組、NPC組及IPC組相比無(wú)明顯差異(p＞0.05);各組動(dòng)物肝組織ATP含量比較：E組、EPC組于再灌流12h后逐漸恢復(fù)，與正常組無(wú)顯著差異(P＞0.05)；其余各手術(shù)組動(dòng)物于再灌流72h后逐漸恢復(fù)正常；I

8、R組和EPC組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但各時(shí)相IR組的ATP值均低于EPC組；NPC組再灌流12h、IPC組再灌流24h的ATP值明顯低于EPC組相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)的ATP值(p＜0.05);肝組織病理觀察：IR組和NPC組可見(jiàn)肝竇內(nèi)淤血及廣泛肝細(xì)胞變性及大量壞死，匯管區(qū)炎癥細(xì)胞聚集，部分肝小葉正常結(jié)構(gòu)破壞；而EPC組、IPC組明顯較前兩者病理?yè)p害輕，可見(jiàn)肝細(xì)胞濁腫變性，散在肝細(xì)胞壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯組織結(jié)構(gòu)破壞。根據(jù)肝臟再灌流2

9、4h各組病理分級(jí)，EPC組明顯優(yōu)于IR及NPC組;Tunel染色法檢測(cè)各手術(shù)組術(shù)后肝細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：EPC組肝細(xì)胞凋亡數(shù)目于再灌流24h、72h顯著少于IPC組，于再灌注1w低于IR組及NPC組；IR組與NPC組各時(shí)相點(diǎn)無(wú)明顯差異，兩組于再灌注12h、24h未發(fā)現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)IR組與NPC組肝細(xì)胞發(fā)生大面積壞死，匯管區(qū)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。提示胃飼乙醇預(yù)處理對(duì)肝臟120min缺血再灌流損傷具有明顯的保護(hù)作

10、用。 采用免疫組織化學(xué)方法觀測(cè)胃飼乙醇以及乙醇預(yù)處理對(duì)缺血再灌流后肝臟HO-1表達(dá)的影響，研究HO-1與肝臟缺血再灌注耐受性的關(guān)系，初步研究胃飼乙醇預(yù)處理對(duì)肝臟缺血再灌注損傷保護(hù)作用的分子機(jī)制。在正常大鼠肝組織內(nèi)僅Kupffer細(xì)胞有微弱表達(dá)，肝細(xì)胞內(nèi)未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá);胃飼乙醇可以誘導(dǎo)HO-1的生成，乙醇胃飼后24hHO-1達(dá)到高峰，逐漸減弱，48h后幾乎無(wú)陽(yáng)性表達(dá);胃飼乙醇預(yù)處理對(duì)120min缺血再灌注損傷肝臟HO-1表達(dá)的影響

11、：EPC組HO-1于再灌注0h即有陽(yáng)性表達(dá)，隨時(shí)相延長(zhǎng)表達(dá)逐漸增強(qiáng)，6h明顯增強(qiáng)，持續(xù)至12h達(dá)到最強(qiáng)，24h后逐漸減弱，至1w仍有弱陽(yáng)性表達(dá)。每一時(shí)相點(diǎn)比較，EPC組HO-1陽(yáng)性表達(dá)均顯著高于其余各組，隨時(shí)相延長(zhǎng)相差明顯。HO-1增強(qiáng)表達(dá)與胃飼乙醇預(yù)處理對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用相一致，提示胃飼乙醇預(yù)處理對(duì)肝臟缺血-再灌注具有一定的保護(hù)作用，而HO-1可能是其保護(hù)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。 結(jié)論:適當(dāng)劑量濃度范圍的乙醇胃飼是一種

12、安全有效的預(yù)處理模式，40％乙醇5g/kg胃飼后24h行肝臟缺血手術(shù)可以增強(qiáng)肝臟對(duì)缺血再灌注損傷的耐受性，經(jīng)該預(yù)處理可以延長(zhǎng)大鼠肝臟耐受缺血的最大安全時(shí)限至120min。 胃飼乙醇預(yù)處理在肝臟缺血120min時(shí)，可以明顯增強(qiáng)肝臟對(duì)缺血再灌注損傷的耐受性，有效減少肝細(xì)胞的壞死和凋亡，更大程度地保留肝組織ATP含量，有效抑制肝臟ALT的釋放，從形態(tài)結(jié)構(gòu)及肝細(xì)胞功能上發(fā)揮保護(hù)作用。 胃飼乙醇預(yù)處理可以有效增強(qiáng)肝臟缺血再灌注損傷