抗瘢痕成纖維細(xì)胞增殖有效成分的篩選及其作用機(jī)理研究.pdf

1、目的:本課題前期實(shí)驗(yàn)表明,大黃、三七、丹參具有較強(qiáng)的抑制瘢痕成纖維細(xì)胞(HSF)增殖的作用,故進(jìn)一步探索3種中藥抗HSF增殖作用的物質(zhì)基礎(chǔ),明確其中主要作用成分,研究其作用機(jī)制,并考察3種中藥提取物抗HSF增殖的最佳配比。
　　方法:采用索氏提取法依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、飽和正丁醇和水對大黃、三七和丹參進(jìn)行提取,制備各溶劑提取樣品;以抗 HSF增殖的活性為導(dǎo)向,MTS法篩選各味中藥的活性提取部位,篩選出的活性提取物采用流式細(xì)

2、胞儀檢測其對細(xì)胞周期的影響。采用 HPLC或 UPLC對其活性提取物進(jìn)行譜效關(guān)系分析,Q/TOF推測出活性較高的成分,利用 PharmMapper數(shù)據(jù)庫對活性化合物進(jìn)行反向分子對接分析,將預(yù)測的靶點(diǎn)利用京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路注釋和分析,得出相關(guān)通路,預(yù)測其抗細(xì)胞增殖的機(jī)制。選取具有代表性的活性化合物,MTS實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞 HE染色驗(yàn)證其抗增殖活性;以組分隱丹參酮為例,RT-PCR檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(

3、caspase-3)、雙特異性絲裂原活化蛋白激酶1(MAP2K1)和絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)增殖相關(guān)基因的表達(dá)水平。最后采用D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì),考察3種中藥提取物抗HSF增殖的最佳配比。
　　結(jié)果:大黃乙酸乙酯提取物、三七乙酸乙酯提取物和丹參石油醚提取物有較高的抗 HSF增殖活性,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示這3個(gè)中藥提取物均能顯著增加 G0/G1期細(xì)胞的比例,顯著降低S期和 G2/M細(xì)胞數(shù)的比例,明顯降低增殖指數(shù)。
　　結(jié)合

4、Q/TOF分析結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道,推測抗 HSF增殖抑制的主要成分分別是:大黃中的大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、沒食子酸等;三七中的人參皂苷Rg1、三七皂苷R2、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1等;丹參中的二氫丹參酮I、丹參新醌B、隱丹參酮、次甲丹參醌和丹參酮II A等;反向?qū)咏Y(jié)果顯示,大黃活性成分可能通過CyclinA、CDK2等主要靶點(diǎn),與Cell cycle、VEGF等信號通路相關(guān);三七活性成分可能通過MAP2K1、MAPK14、HRA

5、S等主要靶點(diǎn),與MAPK、Focal adhesion等信號通路相關(guān);丹參活性成分可能通過 MAP2K1、Caspase-3、MAPK14等主要靶點(diǎn),與VEGF、MAPK、Focal adhesion等信號通路相關(guān)。
　　分別以大黃素、大黃酸、沒食子酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rh1和隱丹參酮為例的驗(yàn)證結(jié)果顯示,這幾種成分均能抑制細(xì)胞的增殖且呈劑量依賴性;RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示,隱丹參酮能夠上調(diào) Caspase-3基因的表達(dá),同

6、時(shí)下調(diào)MAP2K1、MAPK1基因的表達(dá),與預(yù)測結(jié)果相吻合。
　　采用D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)法考察出3種中藥提取物抗HSF增殖的最佳配比為:丹參石油醚提取物為40％、大黃乙酸乙酯提取物為35%、三七乙酸乙酯提取物為25%。
　　結(jié)論:大黃、三七和丹參的主要活性成分分別為蒽醌類化合物、皂苷類、丹參酮類化合物,其作用的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)MAPK、VEGF、Cell cycle、Focal adhesion等信號通路有關(guān)。丹參石油醚、大黃乙