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文檔簡介
1、人類乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)屬于DNA病毒。HBV能引起人類急、慢性肝炎和肝細(xì)胞癌。與其他病毒性疾病一樣,HBV的感染可能是由病毒外膜上的蛋白與宿主細(xì)胞膜上的一個(gè)或多個(gè)受體結(jié)合而引發(fā)。HBV只能感染人類和某些靈長類細(xì)胞,而缺乏在體外細(xì)胞系細(xì)胞內(nèi)的繁殖和傳播能力。HBV的復(fù)制及細(xì)胞損傷主要限于肝臟,肝細(xì)胞是HBV的主要宿主細(xì)胞,而HBV在肝外存在及復(fù)制的意義尚不清楚。 本課題的目的就是要建立一種新型的
2、理想而又經(jīng)濟(jì)的HBV受體研究的小鼠模型,并初步探討SCCA1在體內(nèi)HBV感染過程中所起的作用。 研究方法質(zhì)粒構(gòu)建:質(zhì)粒pMC-LacZ和pMC-SCCA1按照陳志英等人文獻(xiàn)中所描述的方法構(gòu)建CsCl-密度剃度離心純化質(zhì)粒并保存于-20℃。通過對比260和280nm的吸收度以及2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度。 半乳糖苷酶測定(X-gal染色):用X-gal染色的方法可以測定外源基因LacZ在小鼠肝臟表達(dá)與否以及表達(dá)位置
3、。小鼠尾靜脈高壓注射含MC-LacZ質(zhì)粒的生理鹽水2ml后24小時(shí)處死動(dòng)物,做10μm肝臟冰凍切片,X-gal溶液染2小時(shí),核固紅復(fù)染30秒,陽性細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核染成藍(lán)色,陰性細(xì)胞為粉紅色。 小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染pMC-SCCA1:小鼠尾靜脈高壓注射含質(zhì)粒pMC-SCCA1的生理鹽水2ml,注射速度保持在0.4ml/s。 小鼠注射人類HBV-DNA陽性血清:24小時(shí)后小鼠尾靜脈注射人類HBV-DNA陽性血清0.3ml,再過24小
4、時(shí)小鼠腹腔注射HBV-DNA陽性人類血清0.3ml,然后于適當(dāng)?shù)臅r(shí)間取小鼠血清和肝臟標(biāo)本檢測。 SCCA1的組織學(xué)免疫組化檢測:小鼠分組:動(dòng)物分為五個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組,實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈高壓注射含pMC-SCCA1的生理鹽水;對照組小鼠尾靜脈高壓注射不含pMC-SCCA1的生理鹽水。五個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別于第3、7、17、27、37天處死;對照組于第3天處死。每組兩只Nod-Scic小鼠。 小鼠分別于實(shí)驗(yàn)第3、7、17、27、3
5、7天處死,制作肝臟石蠟切片作SCCA1免疫組化檢查。 小鼠肝臟HBsAg免疫組化檢測:檢測方法同上,一抗為山羊抗-HBsAg.小鼠分組:動(dòng)物分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組和6個(gè)對照組,每組兩只Nod-Scid小鼠。所有實(shí)驗(yàn)組小鼠于第-2天尾靜脈高壓注射含pMC-SCCA1的生理鹽水2ml,第-1天尾靜脈注射含HBV-DNA的乙型肝炎患者血清0.3ml,第0天小鼠腹腔注射含HBV-DNA的乙型肝炎患者血清0.3ml,五個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別于第3、7、17
6、、27、37天處死;對照組1-5的小鼠于第-2天尾靜脈高壓注射不含pMC-SCCA1的生理鹽水2ml,第-1天尾靜脈注射含HBV-DNA的乙型肝炎患者血清0.3ml,第0天小鼠腹腔注射含HBV-DNA的乙型肝炎患者血清0.3ml,五個(gè)對照組分別于第3、7、17、27、37天處死。對照組6小鼠于第-2天尾靜脈高壓注射含pMC-SCCA1的生理鹽水2ml,第-1天尾靜脈注射生理鹽水0.3ml,第0天小鼠腹腔注射生理鹽水0.3ml,第3天處死
7、。對照組7為正常小鼠,無任何注射。 小鼠血清HBsAg的ELISA檢測:采用美國雅培公司HBsAg定性檢測試劑盒和配套設(shè)備AXSYMsystem檢測,操作按照說明書進(jìn)行。 小鼠血清和肝臟的HBV-DNA-PCR定性檢測:分別采用不同方法取得小鼠血清和肝臟的DNA溶液,然后用中山大學(xué)達(dá)安基因檢測中心的HBV-DNA-PCR定性檢測試劑盒以及2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。 結(jié)果以LacZ作為報(bào)告基因,我們可以很方便快捷地檢
8、測外源基因的表達(dá)與否及位置。在小鼠尾靜脈高壓注射含MC-LacZ質(zhì)粒的生理鹽水2ml后24小時(shí),肝臟冰凍切片X-gal溶液染色顯示外源基因可以在小鼠肝臟內(nèi)表達(dá),陽性細(xì)胞主要聚集在小鼠肝臟中央靜脈周圍。 SCCA1的表達(dá)方式和陽性表達(dá)的細(xì)胞種類可以通過免疫組化的方法測定。小鼠尾靜脈高壓注射含MC-SCCA1質(zhì)粒的生理鹽水2ml24小時(shí)后,做肝臟石蠟切片檢測SCCA1陽性表達(dá)細(xì)胞。結(jié)果顯示有一定數(shù)量的肝細(xì)胞為陽性反應(yīng),這些細(xì)胞主要聚
9、集在中央靜脈和肝竇狀隙附近。SCCA1陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示SCCA1的陽性表達(dá)率大約30%,并可持續(xù)至少37天。 小鼠肝臟的HBsAg的免疫組化結(jié)果顯示,在不事先注射pMC-SCCA1的小鼠肝臟內(nèi),如果直接向小鼠體內(nèi)輸入乙肝患者HBV-DNA陽性血清(對照組),在小鼠肝臟內(nèi)將無法檢測到HBsAg陽性反應(yīng);相反地。在事先注射pMC-SCCA1的小鼠肝臟內(nèi),再向小鼠體內(nèi)輸入乙肝患者HBV-DNA陽性血清(實(shí)驗(yàn)組),在小鼠肝臟內(nèi)可以見
10、到HBsAg陽性反應(yīng)細(xì)胞,這些細(xì)胞主要集中在中央靜脈和肝竇狀隙附近,包括肝細(xì)胞、Kupffer氏細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞,HBsAg陽性反應(yīng)長達(dá)17天,在實(shí)驗(yàn)第27、37天則未檢測到陽性細(xì)胞。 小鼠血清HBsAg定性ELISA檢測顯示,在對照組(第一組,不事先尾靜脈注射pMC-SCCA1而直接向小鼠體內(nèi)輸入乙肝患者HBV-DNA陽性血清)中,第3天顯示陽性,而在第7、17、27、37天均為陰性;而在實(shí)驗(yàn)組(第二組,事先尾靜脈注射pMC
11、-SCCA1再向小鼠體內(nèi)輸入乙肝患者HBV-DNA陽性血清)中,第3、7天可檢測到陽性反應(yīng),17天后均為陰性。 HBV-DNA-PCR定性檢測結(jié)果顯示,在對照組中,第3天時(shí)小鼠血清和肝臟都為陽性反應(yīng),第7天以后,血清和肝臟中均無法檢測到HBV-DNA;實(shí)驗(yàn)組在第3、7天時(shí),血清和肝臟標(biāo)本均為陽性,肝臟標(biāo)本的陽性反應(yīng)時(shí)間更長,到第17天是染為陽性,但27、37天時(shí)為陰性反應(yīng)。 討論肝臟不僅負(fù)責(zé)合成多種蛋白,同時(shí)也涉及大量的
12、遺傳性和獲得性疾病的發(fā)生發(fā)展,所以肝臟也是基因治療研究的重要靶器官。而載體是轉(zhuǎn)基因的重要工具,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的載體工具,包括重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體以及非病毒載體,例如脂質(zhì)體、陽離子聚合體和再造乳糜微粒。雖然肝臟轉(zhuǎn)基因研究已經(jīng)取得很大進(jìn)展,但每種載體的應(yīng)用都還存在許多困難和問題。例如,重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體雖然可以實(shí)現(xiàn)外源基因在肝臟的長期表達(dá)。但這一結(jié)果需要進(jìn)行肝部分切除或肝損傷來刺激肝細(xì)胞的再生和分化;腺病毒載體
13、可以提高轉(zhuǎn)基因的效率,但由于引起宿主的免疫反應(yīng)而縮短外源基因的表達(dá)時(shí)間;腺相關(guān)病毒載體可以使外源基因長期表達(dá),但其攜帶外源基因的長度不能超過5.2kb;目前己知的非病毒載體的轉(zhuǎn)基因效率較低。為了解決在小鼠體內(nèi)外源基因轉(zhuǎn)染的困難,Zhang等人探索出一種小鼠尾靜脈高壓注射技術(shù),使外源基因到達(dá)并轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞,他們的實(shí)驗(yàn)證明在進(jìn)行這種操作后,小鼠肝臟是體內(nèi)唯一表達(dá)外源基因的器官,陽性反應(yīng)長達(dá)6個(gè)月以上。在本課題中,我們利用小鼠尾靜脈高壓注射
14、技術(shù)成功地將HBV結(jié)合蛋白基因SCCA1轉(zhuǎn)染至HBV的宿主器官——肝臟。 在人類疾病的基因治療中,由于普通載體會(huì)造成外源基因表達(dá)逐漸下降,在一定程度上限制了非病毒載體的應(yīng)用。陳志英等人最先證實(shí)了,在載體中與哺乳類動(dòng)物表達(dá)盒(mammalianexpressioncassette)相連的細(xì)菌DNA序列導(dǎo)致了體內(nèi)外源基因的反轉(zhuǎn)錄沉默。對此,他們發(fā)明了一種)噬菌體φC31整合酶介導(dǎo)的分子內(nèi)再結(jié)合技術(shù),去除造成基因沉默的細(xì)菌序列,由此而
15、得到小環(huán)DNA載體(minicirleDNAvector),實(shí)驗(yàn)證明,小環(huán)DNA載體使報(bào)告基因humanfactorⅨandα1-antitrypsin的表達(dá)量分別提高了45倍和560倍。小環(huán)DNA載體可以為疾病的基因治療提供有效的工具。在本課題中,我們以小環(huán)DNA載體為工具,實(shí)現(xiàn)了HBV結(jié)合蛋白基因SCCA1的穩(wěn)定表達(dá),這種轉(zhuǎn)基因小鼠將為HBV受體研究提供非常有用的動(dòng)物模型。 在此小鼠模型上,我們對HBV結(jié)合蛋白基因SCCA1
16、的受體功能進(jìn)行了初步研究。各項(xiàng)檢測結(jié)果,不論是免疫組化染色、ELISA或者HBV-DNA-PCR檢測,都顯示了在小鼠尾靜脈高壓注射了pMC-SCCA1后,HBV在小鼠體內(nèi)滯留時(shí)間明顯延長。這一發(fā)現(xiàn)提示pMC-SCCA1的表達(dá)產(chǎn)物-HBV結(jié)合蛋白有助于HBV與宿主細(xì)胞膜的黏附,另外也提示,在介導(dǎo)病毒內(nèi)吞的過程中,HBV結(jié)合蛋白可能是作為聯(lián)合受體而起重要作用。但其在HBV感染過程中所起的具體作用仍需進(jìn)一步的研究來證實(shí)。 除此之外,我
17、們的研究還發(fā)現(xiàn),肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和Kupffer氏細(xì)胞在免疫組化染色中呈現(xiàn)較強(qiáng)的陽性反應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)提示這些細(xì)胞可能對于HBV病毒的清除具有重要的作用,這些細(xì)胞是抵御HBV病毒感染的前沿防線,它們?nèi)绻霈F(xiàn)免疫功能障礙可能會(huì)提高HBV感染肝細(xì)胞的機(jī)會(huì)。 本課題的研究結(jié)果顯示,通過小鼠尾靜脈高壓注射小環(huán)DNA載體的方法,可以實(shí)現(xiàn)外源基因,疑似HBV受體基因在小鼠肝臟內(nèi)的長期穩(wěn)定的表達(dá),這種小鼠將為HBV受體基因研究提供合適而又經(jīng)濟(jì)的動(dòng)物模
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