脾細胞輸注致敏對造血干-祖細胞植入的影響及機制研究.pdf

1、本文擬通過同種異基因脾細胞輸注的方法建立致敏的動物模型，深入探討致敏對HSCT的影響及作用機制。 第一部分脾細胞輸注致敏模型的建立及其對移植的影響 目的：建立脾細胞致敏的動物模型，研究致敏動物體內免疫功能的改變，并探討致敏對HS/PCs植入的影響。 方法： 1.致敏模型的建立,于脾細胞輸注結束后第7天檢測BALB/c小鼠的免疫功能并將其作為移植受者。 2.免疫功能檢測： 2.1由尾靜脈采血

2、檢測各組受者血常規(guī)及應用流式細胞儀檢測脾細胞CD3+、CD19+、CD4+、CD8+細胞百分比。 2.2分離各組受者的血清，通過補體依賴淋巴細胞毒性實驗檢測血清抗體滴度，ELISA方法檢測血清中細胞因子IFN—γ的水平。 2.3分離各組致敏受者的脾細胞作為效應細胞，C57BL/6小鼠脾臟細胞作為刺激細胞，以3H—TdR進行標記，通過混合淋巴細胞反應計算刺激指數(shù)。 3.異基因骨髓移植： 3.1移植前5天各組

3、BALB/c小鼠開始飲用含抗生素的飲用水，同時建立照射未移植組。 3.2每天觀察移植后受鼠的生存情況，瀕死動物取肝、肺、脾、腸管、足墊皮膚等組織作病理檢查。 4.統(tǒng)計分析：采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。 結果： 1.各組受者血象及外周血中CD3+、CD19+、CD4+、CD8+細胞百分比的差異均無明顯統(tǒng)計學意義。 2.致敏血清中細胞毒性指數(shù)均高于正常對照組，且其數(shù)值與脾細胞輸注的數(shù)量及次數(shù)呈正相關

4、。 3.各組血清中IFN—γ均很低，致敏組血清IFN—γ與正常組的差別均無統(tǒng)計學意義。 4.MLR實驗結果示1×10E5組的刺激指數(shù)稍高于正常組，但其差別無統(tǒng)計學意義；而1×10E6組及1×10E6 qw×2組的刺激指數(shù)均明顯高于正常組，差別有統(tǒng)計學意義。 5.單純照射未移植組的小鼠于照射后10～16天全部死亡。 6.瀕死前取股骨病理檢查證明骨髓細胞明顯衰竭，而肝臟、腸管、皮墊等組織均未發(fā)現(xiàn)明顯的淋巴細胞

5、浸潤。 結論： 1.通過同種異基因脾細胞輸注的方法建立了不同致敏程度的動物模型。 2.異基因供者HS/PCs不能挽救經致死量照射的脾細胞輸注致敏模型。 3.1×10E6 qw×2脾細胞輸注組的致敏程度最高，符合臨床反復輸血致敏的過程，將以此致敏模型進行以下的實驗研究。 第二部分異基因造血干/祖細胞在致敏模型的歸巢與植入 目的：探討異基因HS/PCs在致敏模型的歸巢與植入情況，明確異基因HS

6、/PCs在致敏受者體內的去向。 方法： 1.致敏模型與骨髓移植。 2.歸巢的觀察指標： 2.1 CFSE標記供者骨髓細胞：取染色后的骨髓細胞即時及體外培養(yǎng)48小時后予流式細胞儀檢測，另取染色后的骨髓細胞即時進行移植。 2.2病理切片示蹤：分別于移植后第2hr、12hr及48hr處死移植受者，取其眼靜脈血進行涂片，并取股骨、脾臟、肝臟及肺臟行冰凍切片，于熒光顯微鏡下計數(shù)每個視野中熒光細胞數(shù)。

7、 2.3流式細胞儀檢測：同時于上述時點制備致敏模型的脾臟細胞、骨髓細胞及眼靜脈血，以紅細胞裂解液溶解紅細胞，流式細胞儀檢測綠色熒光的強度。 3.植入的觀察指標： 3.1生存分析：移植后每日觀察致敏模型的生存狀況，記錄死亡時間，繪制生存曲線。 3.2外周血象恢復：移植后每周從致敏模型尾靜脈采血20μl，用KX—21血細胞計數(shù)儀檢測WBC、Hb及PLT等。 3.3骨髓細胞計數(shù)：移植后每周分離致敏模型的股骨，計

8、數(shù)每根股骨中骨髓細胞的數(shù)量，并取骨髓細胞進行以下集落培養(yǎng)及嵌合分析。 3.4集落培養(yǎng)：取2×104骨髓細胞置于1ml甲基纖維素半固體培養(yǎng)體系進行集落培養(yǎng)，7天后計算CFU—GM集落數(shù)。 3.5嵌合分析：取受者骨髓細胞予FITC—H—2Db標記，檢測供者HS/PCs嵌合程度。 4.統(tǒng)計分析：與第一部分相同。 結果： 1.予綠色熒光染料CFSE體外標記供者骨髓細胞，兩者差異無統(tǒng)計學意義。 2.

9、歸巢實驗的冰凍切片結果顯示，熒光標記供者細胞在受者肝臟、肺臟的分布隨時間推移呈逐漸減少。 3.流式細胞儀結果顯示移植后2小時，熒光細胞在非致敏組與致敏組的骨髓及脾臟的分布無明顯差異。 4.非致敏及致敏受者予照射及異基因骨髓移植后經Log—rank檢驗兩組的生存率差異有明顯統(tǒng)計學意義。 5.非致敏組受者于移植照射后其血象及骨髓細胞隨時間推移呈進行性增加，于移植后第28天已恢復到正常水平；而致敏組受者同樣經照射移植后

10、其血象及骨髓細胞隨時間推移呈進行性下降。 6.移植后取受者骨髓細胞進行集落培養(yǎng)。 7.供者細胞嵌合分析結果。 結論： 1.歸巢實驗表明，與非致敏移植受者相比，異基因供者HS/PCs主要在致敏受者外周血、骨髓及脾臟等部位被清除。 2.通過植入實驗的多種研究方法表明異基因供者HS/PCs在非致敏受者體內能有效植入，而在致敏受者體內卻被完全排斥。 第三部分致敏對異基因造血干/祖細胞損傷的機制研究

11、 目的：分析致敏受者血清及免疫細胞對異基因HS/PCs的損傷作用，探討致敏受者產生移植排斥的機制。 方法： 1.致敏模型：同樣按第一部分建立的致敏模型。 2.二抗結合實驗：應用流式細胞儀進行檢測。 3.免疫損傷機制： 3.1 CDC實驗：將致敏或非致敏BALB/c小鼠的血清與C57BL/6骨髓細胞于體外孵育不同時間，再加入兔補體繼續(xù)孵育30 min，然后予熒光染料EB/AO標記，計算細胞死

12、亡百分比。 3.2 CTL實驗：分離致敏或非致敏BALB/c小鼠脾細胞，檢測骨髓細胞的死亡百分比，計算細胞毒性指數(shù)。 3.3 ADCC實驗：再加入熒光標記PE—PI，計算細胞毒性指數(shù)。 4.血清對HS/PCs凋亡的影響：加熒光標記FITC—AnnexinV，應用流式細胞儀進行檢測。 5.血清對造血祖細胞增殖分化的影響：C57BL/6骨髓細胞與致敏或非致敏BALB/c小鼠的血清于37℃孵育90min，然后加

13、入終濃度為10％的兔補體，再孵育30min，洗滌后重懸細胞，骨髓細胞置于1ml甲基纖維素半固體培養(yǎng)體系進行集落培養(yǎng)，計數(shù)CFU—GM。 6.血清孵育或過繼輸注的移植實驗： 6.1將致敏或非致敏BALB/c小鼠的血清與供者C57BL/6骨髓細胞在體外孵育1小時，洗滌后回輸?shù)浇?Gy照射后的BALB/c小鼠，觀察移植后的生存情況。 6.2在移植前1天將200μl致敏或非致敏BALB/c小鼠的血清注射到正常BALB/c

14、小鼠中，經8Gy照射后予移植1×107C57BL/6小鼠的骨髓細胞，觀察移植后生存情況。 7.統(tǒng)計分析：與第一部分相同。 結果： 1.經非致敏或致敏血清孵育的骨髓細胞與羊抗鼠IgG二抗結合，兩組差別有明顯統(tǒng)計學意義。 2.CDC實驗結果示在與補體孵育30min或1hr后，致敏血清組死亡細胞百分比明顯高于非致敏血清組，其差異有統(tǒng)計學意義。CTL實驗中，非致敏血清組與致敏血清組的細胞毒性指數(shù)差別有明顯統(tǒng)計學意

15、義；ADCC實驗中，兩組的細胞毒性指數(shù)差別有統(tǒng)計學意義。 3.凋亡實驗結果示非致敏組與致敏組的骨髓細胞，兩組差異無明顯統(tǒng)計學意義。 4.集落培養(yǎng)結果示非致敏組與致敏組的骨髓細胞中CFU—GM數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義。 5.血清孵育骨髓細胞后進行移植，經Log—rank檢驗兩組的生存率差異有明顯統(tǒng)計學意義。 6.血清過繼移植實驗中，移植前予致敏血清輸注的受者有80％也于移植后10天左右均死于骨髓衰竭，而接受非致

16、敏血清輸注的受者能長期存活，經Log—rank檢驗兩組的生存率差異有明顯統(tǒng)計學意義。 結論： 1.致敏血清抗體能與異基因HS/PCs相結合，致敏受者能通過免疫途徑CDC、CTL、ADCC等免疫途徑損傷異基因HS/PCs。 2.致敏血清對異基因HS/PCs凋亡及體外增殖分化均無明顯影響。 3.血清孵育及過繼移植實驗均表明致敏血清能引起異基因HS/PCs的移植失敗，說明血清抗體介導的體液免疫在移植排斥中發(fā)揮重

17、要作用。 全文結論 1.通過同種異基因脾細胞輸注的方法建立不同致敏程度的動物模型，該致敏模型體內免疫功能的變化與脾細胞輸注的數(shù)量及次數(shù)有關。 2.歸巢實驗表明，異基因供者HS/PCs主要在致敏受者外周血、骨髓及脾臟等部位被清除。 3.通過植入實驗的多種研究方法表明異基因供者HS/PCs在非致敏受者體內能有效植入，而在致敏受者體內卻被完全排斥。 4.致敏血清抗體能與異基因HS/PCs相結合，致敏受者