三葉草的細胞學、分子標記及多倍體誘導研究.pdf

1、三葉草是豆科蝶形花亞科三葉草屬植物,其中白三葉、雜三葉是優(yōu)質(zhì)牧草,紅三葉既是優(yōu)質(zhì)牧草又是藥用植物,其提取物具有植物雌激素樣作用和抗癌作用,是目前國際上公認的治療更年期綜合征療效確切的植物藥。以上三種三葉草在我國有著廣泛的分布,經(jīng)長期的自然選擇和人工選擇,三葉草種內(nèi)產(chǎn)生了明顯的分化,形成了豐富的種質(zhì)資源。本研究運用常規(guī)的細胞學方法和近年來新發(fā)展起來的SRAP分子標記技術(shù)對8種三葉草的種質(zhì)資源進行了遺傳多樣性的研究,以期為三葉草的品種選育及

2、三葉草種間親緣關(guān)系的研究提供細胞學和遺傳學依據(jù)。此外,本文還對實驗中意外發(fā)現(xiàn)的一種白三葉材料中的B染色體進行了研究,并進一步探索了巴東紅三葉草多倍體的誘導方法。其主要結(jié)果如下:
　　 1.細胞學研究
　　 不同品種的白三葉草染色體數(shù)目相同均為2n=32,不同品種的紅三葉草染色體數(shù)目為2n=14,雜三葉2n=16。其中有一種白三葉草除具有正常的32條染色體外,還發(fā)現(xiàn)有B染色體存在。白三葉草中具有葉型變異的植株與葉型正常植株

3、的染色體數(shù)目相同,均為2n=32。核型分析結(jié)果表明:不同品種白三葉草的核型公式、染色體相對長度組成和核型類型均存在較大差異；與已報道的白三葉草雖然在染色體數(shù)目上相同,但核型公式、染色體相對長度組成和核型類型等方面存在差異。不同品種紅三葉草之間的核型公式、染色體相對長度組成和核型類型也有較大差異。說明不同品種的白三葉草和不同品種的紅三葉草在細胞水平上均存在遺傳多樣性。
　　 2.SRAP分子標記
　　 經(jīng)過PCR反應體系和

4、擴增體系的優(yōu)化,共篩選出40對SRAP引物對4份白三葉草、3份紅三葉草、1份雜三葉草及其10份葉型變異材料進行擴增。共擴增出792條帶,其中多態(tài)性條帶426,每個引物組合的多態(tài)性條帶數(shù)為3-38不等,平均每個引物組合產(chǎn)生個多態(tài)性條帶10.8,說明SRAP分子標記完全可以應用于三葉草的遺傳學研究。本試驗中優(yōu)化的SRAP分子標記體系也為今后其應用打基礎(chǔ)。
　　 在相似系數(shù)為0.568時,可以將供試材分為3大類,一類為雜三葉草；一類為

5、紅三葉草;另一類為白三葉草。雜三葉與紅三葉的親緣關(guān)系相對較近,相似系數(shù)為0.559,與白三葉的親緣關(guān)系相對較遠,相似系數(shù)0.504。在白三葉草中,相似系數(shù)為0.879時,可分為六類:三種白三葉草的親緣關(guān)系最近為一類,武漢野生白三葉草一類,葉型變異的白三葉草分為四類。在DNA分子水平上,與白三葉草相比,紅三葉草種內(nèi)存在更為豐富的遺傳多樣性,特別是巴東紅三葉草與另外兩種紅三葉草的親緣關(guān)系相對較遠,平均遺傳相似系數(shù)僅為0.482。說明紅三葉草

6、種內(nèi)資源能為優(yōu)良品種的選育提供好的基礎(chǔ)。
　　 從SRAP標記聚類分析得到有葉型變異植株和正常植株并沒有聚為一類,其相似系數(shù)低于白三葉草種內(nèi)相似系數(shù),說明葉型變異植株和正常植株在DNA序列上有差異。
　　 3.白三葉草B染色體研究
　　 本研究發(fā)現(xiàn)在白三葉草的一個品種中有B染色體存在,其它幾個品種中并未發(fā)現(xiàn)。前人對白三葉草的染色體數(shù)目及減數(shù)分裂過程中的染色體行為及核型分析已有研究,但都沒有關(guān)于發(fā)現(xiàn)B染色體的報道。

7、對具有B和不具有B的核型比較觀察,二者沒有明顯差異。B染色體形態(tài)上比A染色體小,通常小于1μm。在同一根尖的細胞中,所含的B染色體數(shù)目不同,在0～3之間變化。通過有絲分裂和減數(shù)分裂觀察表明,B染色體是額外的,全部異染色質(zhì)化,分離不規(guī)則。05年、06年B染色體在群體中的頻率變化不大,差異不顯著。
　　 4.巴東紅三葉草的多倍體誘導
　　 以巴東紅三葉草為材料,用秋水仙素直接處理萌動的種子和組織培養(yǎng),進行了多倍體誘導方法的研

8、究。結(jié)果表明:在秋水仙素3個濃度梯度和4個時間梯度的誘導中,濃度為0.1％和時間為16h效果較好。取根尖進行染色體制片觀察顯示有四倍體和嵌合體。
　　 在組織培養(yǎng)誘導中,以葉片、葉柄、子葉和下胚軸為外植體愈傷組織的誘導率都在90％以上,但從愈傷的長勢和質(zhì)量看,下胚軸是最理想的誘導材料。在培養(yǎng)基中添加1.1mg/L秋水仙素溶液處理15d效果最佳,再生植株的誘導率最高為46.7％,離體間接誘導法總體上要比活體誘導法效果好,可獲得較多