地塞米松磷酸鈉導致斑馬魚顱面部發(fā)育異常的研究.pdf

1、糖皮質激素是一類內(nèi)源性的類固醇激素，其表達受下丘腦-垂體-腎上腺軸控制。這些糖皮質激素調節(jié)細胞生長，分化和凋亡，在生命活動的調節(jié)中起著非常重要的作用。糖皮質激素類藥物地塞米松磷酸鈉是一類應用廣泛的處方藥，主要作用是抗炎和免疫抑制。臨床上用于治療哮喘，皮炎，風濕性關節(jié)炎和一些自身免疫性疾病，也用于抑制移植排斥反應。然而，地塞米松磷酸鈉也具有致畸作用，最常見的致畸效應就是腭裂。
　　 通常使用哺乳動物模型研究人類疾病和篩選藥物，這是

2、由于哺乳動物基因組具有高度同源性。但是，建立哺乳動物模型耗時，昂貴，而且在體和離體實驗數(shù)據(jù)相差較大，不能有效的進行毒性預測。
　　 斑馬魚是最具有潛力的在體毒理學模式生物之一。它是一種公認的評價藥物發(fā)育毒性的理想模型。斑馬魚胚胎發(fā)育過程中對環(huán)境因素的影響極為敏感。而且斑馬魚胚胎實驗是一種無痛的在體實驗，正在逐漸替代其他類型的動物實驗。斑馬魚用于毒性實驗，很大程度上得益于與人類基因組高度同源?；虻耐葱允沟冒唏R魚有與人類類似的生

3、理和解剖學特征。對外源性化學物質的反應也與人類非常類似。而且，斑馬魚胚胎的透明特征使得實驗中可以直接觀察胚胎發(fā)育的各個時期，包括器官形成，血管形成和毒性反應中形態(tài)學的變化。最后，斑馬魚實驗費用低，這是因為斑馬魚個體小，需要的養(yǎng)殖費用相對哺乳動物大大降低。
　　 目前國內(nèi)外以斑馬魚為模式生物進行藥物毒性試驗和前期篩選尚處于起步階段，本文以斑馬魚為模式生物通過測定LC50值，觀察形態(tài)學改變，測定相關基因表達的改變，研究地塞米松磷酸鈉

4、導致斑馬魚顱面部發(fā)育異常的機制，同時建立一種以斑馬魚為模式生物簡便的預測藥物發(fā)育毒性的方法。
　　 第一部分：地塞米松磷酸鈉對斑馬魚半數(shù)致死濃度的測定
　　 目的：研究地塞米松磷酸鈉對斑馬魚的半數(shù)致死濃度，評價斑馬魚模型對哺乳動物毒性數(shù)據(jù)預測的準確性。
　　 方法：采用寇氏法計算地塞米松磷酸鈉對斑馬魚的LC50值，將所得結果與哺乳動物的半數(shù)致死量進行線性回歸分析。
　　 結果：測定得地塞米松磷酸鈉對斑馬魚

5、的LC50值為443.86mg/L。且與大鼠的LD50值存在線性關系。
　　 結論：斑馬魚作為動物模型分析藥物毒性，所需藥物量少，且對哺乳動物的LD50具有良好的預測性。
　　 第二部分：地塞米松磷酸鈉導致斑馬魚顱面部畸形
　　 目的：以斑馬魚作為模式生物，研究地塞米松磷酸鈉對斑馬魚顱面部發(fā)育的毒性，以期建立起一種快速，直觀，準確的藥物發(fā)育毒性的動物模型評價體系。
　　 方法：斑馬魚胚胎分為4組，分別為c

6、ontrol組，地塞米松磷酸鈉5，10，50mg/L實驗組，進行作用至受精后96小時停止。計算胚胎的孵出率，存活率，畸形率和心率；進行體視顯微鏡觀察，AO染色和Alcian-Blue染色后觀察斑馬魚胚胎及幼魚顱面部發(fā)育畸形和細胞凋亡情況。
　　 結果：與control組相比，斑馬魚胚胎的孵出率，存活率，畸形率和心率均發(fā)生變化，其中畸形率變化顯著，50 mg/L實驗組畸形率高達71.33±6.5%，相對于control組4.67±

7、1.8%；體視顯微鏡觀察到各實驗組均有發(fā)育畸形現(xiàn)象存在，50 mg/L實驗組畸形最為嚴重；AO染色顯示相對于control組，5，10，50mg/L實驗組均存在細胞調亡現(xiàn)象；Alcian-Blue染色進一步證實了地塞米松磷酸鈉導致顱面部軟骨發(fā)育畸形。
　　 結論：應用斑馬魚為模式生物進行地塞米松磷酸鈉顱面部發(fā)育毒性實驗，所得數(shù)據(jù)與其他模式生物實驗數(shù)據(jù)一致。斑馬魚為模式生物進行發(fā)育毒性分析耗時少，成本低，結果具有良好的預測性，可以

8、作為傳統(tǒng)模式生物的替代模型快速，直觀，準確的進行藥物毒性評價。
　　 第三部分：地塞米松磷酸鈉對斑馬魚顱面發(fā)育相關基因表達的影響
　　 目的：研究地塞米松磷酸鈉對斑馬魚顱面部發(fā)育相關基因表達的影響。同時以斑馬魚為模式生物，建立一種通過測定相關基因的表達變化，研究化合物發(fā)育毒性的便捷方法。
　　 方法：斑馬魚胚胎分為4組，分別為control組，地塞米松磷酸鈉5，10，50mg/L實驗組，進行作用至受精后96小時停

9、止。采用熒光定量PCR法測定斑馬魚中顱面部發(fā)育相關基因egf、tgf β1和mmp-13的表達水平。
　　 結果：與control組相比，地塞米松磷酸鈉作用后48，72，96小時均促進egf、tgf β1和mmp-13 mRNA表達水平升高。
　　 結論：地塞米松磷酸鈉引起egf、tgf β1和mmp-13 mRNA表達水平升高，斑馬魚顱面部發(fā)育異?？赡芘c這些基因的表達增多有關。同時，斑馬魚與哺乳動物的蛋白質結構功能具有