EMT在非小細胞肺癌EGFR-TKIs獲得性耐藥中的作用及機制研究.pdf

1、背景和目的：
　　肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，已經(jīng)成為癌癥病人死亡的最常見原因。近年來，分子靶向治療成為研究熱點并運用于臨床，以吉非替尼為代表的表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factorreceptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)已經(jīng)用于EGFR(epidermal growth factor receptor，EGFR)突變型晚期

2、NSCLC的一線、二線治療，對EGFR野生型NSCLC的有效率也達到5％-6％[1]，然而耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)成為制約EGFR-TKIs進一步應用的瓶頸，使使用EGFR-TKIs治療的患者的中位無進展時間僅為8～10個月[2]。因此，研究和發(fā)現(xiàn)EGFR-TKIs獲得性耐藥機制，積極尋找逆轉(zhuǎn)耐藥的新方法具重要的臨床意義。
　　本課題組的前期研究已證實，EGFR野生型的NSCLC細胞H460在EGFR-TKIs獲得性耐藥過程中發(fā)生了EMT，

3、提示EMT可能在EGFR野生型NSCLC獲得性耐藥過程中起重要作用[9]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymaltransi ion，EMT)，是上皮細胞失去上皮特性，獲得間質(zhì)細胞表型的一種生物現(xiàn)象，發(fā)生EMT后，細胞E-鈣黏蛋白、角蛋白等上皮標記基因表達降低，波形蛋白、纖維連接素、N-鈣黏蛋白等間質(zhì)標記基因表達升高。EMT與腫瘤細胞的原位侵襲和遠處轉(zhuǎn)移、藥物耐藥有密切關(guān)系[10,11]，且與NSCLC的預后[12]

4、及對EGFR-TKIs敏感性密切相關(guān)[13-16]。
　　與基礎(chǔ)研究結(jié)果一致，E-cadherin表達水平可作為預測NSCLC患者對EGFR-TKIs臨床療效的一個新的生物學標記。一項觀察EGFR-TKIs聯(lián)合化療治療NSCLC的國際多中心隨即Ⅲ期臨床研究結(jié)果顯示:E-cadherin表達陽性的患者疾病進展時間明顯延長[23]。吉非替尼一線治療NSCLC，E-cadherin表達陽性的患者總生存顯著長于E-cadherin表達陰性

5、的患者[24]。
　　多種轉(zhuǎn)錄因子密切參與了EMT的發(fā)生，目前發(fā)現(xiàn)Snail、Slug、Twist、ZEB1、Smad、NF-B等[25]。研究發(fā)現(xiàn)，EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(ZEB1、slug)在吉非替尼獲得性耐藥的過程中也起到關(guān)鍵性的調(diào)控作用，靶向消除Slug的表達能逆轉(zhuǎn)耐藥細胞株的間質(zhì)化特征，恢復耐藥細胞株對吉非替尼的敏感性[26]。對于NSCLC細胞發(fā)生EMT后EGFR-TKIs治療敏感性下降的分子細胞學機制目前尚未闡明。

6、>　　因此，在課題組前期工作的基礎(chǔ)上，本課題擬通過構(gòu)建靶向CDH1基因的過表達慢病毒表達載體感染EGFR野生型和突變型NSCLC細胞，提高E-cadherin的表達水平，逆轉(zhuǎn)細胞的EMT，觀察耐藥細胞對EGFR-TKIs的敏感性變化，探討EMT在NSCLC細胞對EGFR-TKIs產(chǎn)生獲得性耐藥中的作用及其可能的分子學機制，為提高EGFR-TKIs療效尋找新靶點和新方法。
　　方法：
　　1、選用EGFR突變型的人肺腺癌細胞P

7、C/9及其吉非替尼耐藥細胞PC9/AB。高分辨率溶解曲線分析技術(shù)(Quantitative PCR high-resolutionmelting，qPCR-HRM)檢測PC9/AB細胞EGFR及Kras基因突變;MTT法檢測兩組組細胞的增殖情況;劃痕實驗和Transwell實驗檢測細胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的改變; Western blot方法檢測兩組細胞的EGFR、p-EGFR、E-cadherin、Vimentin、Snai l等的蛋白水平

8、的表達變化。
　　2、利用GV218質(zhì)粒構(gòu)建靶向CDH1（NM-004360）（E-cadherin基因）的過表達載體和陰性對照載體，并用PCR電泳鑒定和基因測序;經(jīng)過鑒定測序的構(gòu)建好的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，用Western Blot外源篩選有效過表達載體;選擇轉(zhuǎn)染效果良好的慢病毒載體進行包裝并測定滴度。
　　結(jié)果：
　　1、PC9/AB細胞和H460/ER細胞的EGFR和K-ras基因突變狀況
　　基因突變

9、檢測結(jié)果顯示，PC9/AB細胞為EGFR基因19號外顯子缺失突變型及K-ras基因野生型，無T790M突變及cMET基因擴增。前期研究結(jié)果顯示，H460/ER細胞為EGFR基因及K-ras基因野生型。
　　2、PC9/AB細胞對EGFR-TKIs敏感性下降
　　MTT法檢測結(jié)果顯示，PC9、PC9/AB細胞均呈無限繁殖。PC9/AB細胞對吉非替尼的增殖作用顯示為濃度依賴性作用，PC9/AB細胞對厄洛替尼的敏感性較PC9細胞顯

10、著下降，IC50值分別為7.23±6.89μ mol/L和0.04±0.00μ mol/L(P＜0.05)。該結(jié)果說明，PC9/AB細胞對EGFR-TKIs產(chǎn)生了獲得性耐藥。
　　3、PC9/AB細胞的形態(tài)學變化
　　PC9/AB的細胞形態(tài)改變與PC9細胞相比，PC-9/AB細胞形態(tài)傾向梭形發(fā)展，細胞間連接變得更加疏松，符合間質(zhì)細胞形態(tài)學表現(xiàn)。
　　4、PC9/AB細胞的遷移及侵襲能力變化劃痕實驗結(jié)果顯示，PC9/AB

11、劃痕兩邊緣距離均明顯縮短。侵襲實驗結(jié)果顯示，PC9/AB穿過Matrigel膠的細胞數(shù)明顯高于原親本細胞。
　　5、PC9/AB的EMT相關(guān)分子和EGFR在蛋白表達的變化
　　western blot結(jié)果顯示，vimentin、snail的蛋白表達水平均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。EGFR、E-cadherin、β-catenin的蛋白表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。以上結(jié)果表明，PC9

12、細胞發(fā)生獲得性耐藥后，發(fā)生了EMT，且EGFR及其磷酸化蛋白表達降低。
　　6、CDH1基因慢病毒過表達載體的構(gòu)建
　　針對CDH1基因成功構(gòu)建了2條過表達慢病毒載體LV-CDH1(5386-1)-P1、LV-CDH1(5386-1)-P2以及陰性對照載體CON136; q-PCR法外源篩選出有效過表達慢病毒載體LV-CDH1(5386-1)并進行病毒包裝，獲得了較高滴度的慢病毒顆粒;感染結(jié)果顯示該慢病毒載體能穩(wěn)定高效轉(zhuǎn)染H

13、460/ER和PC9/AB細胞。Q-PCR方法Western blot結(jié)果表明LV-CDH1(5386-1)慢病毒對H460/ER細胞的CDH1基因的mRNA水平提升了約16倍，蛋白表達水平明顯升高，LV-CDH1(5386-1)慢病毒對PC9/AB細胞的CDH1基因的mRNA水平提升了約4倍，蛋白表達水平明顯升高。
　　7、高表達E-cadherin后的H460/ER和PC9/AB細胞形態(tài)變化
　　與陰性對照細胞相比，PC

14、9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1細胞形態(tài)傾向橢圓形發(fā)展，細胞間連接變得緊密，符合上皮細胞形態(tài)學表現(xiàn)。
　　8、高表達E-cadherin后細胞的遷移和侵襲能力變化
　　劃痕實驗結(jié)果顯示，與陰性對照細胞相比，PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1細胞的劃痕兩邊緣距離均明顯增寬。侵襲實驗結(jié)果顯示，陰性對照細胞穿過Matrigel膠的細胞數(shù)明顯高于PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1細胞。以上結(jié)果

15、表明，高表達E-cadherin后，PC-9/AB和H460/ER細胞的細胞侵襲和遷移能力均明顯降低。
　　9、高表達E-cadherin后細胞EMT相關(guān)分子的蛋白水平變化
　　與陰性對照細胞相比，PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1細胞的vimentin、snail的蛋白表達水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;E-cadherin、β-catenin的蛋白表達水平均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜

16、0.05)。以上結(jié)果表明，高表達E-cadherin后，細胞發(fā)生了去EMT的變化。
　　10、高表達E-cadherin后細胞對EGFR-TKIs的敏感性變化
　　MTT結(jié)果顯示，PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1細胞均呈無限繁殖。吉非替尼(0.01～10μmol/L)可抑制PC-9/AB-CDH1細胞生長，該抑制作用呈濃度依賴性;PC9/AB-CDH1與陰性對照細胞相比，對吉非替尼的敏感性增加約11.4倍，I

17、C50值分別為(0.70±0.22)μmol/L和(8.68±0.44)μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。厄洛替尼(10～100μmol/L)可抑制H460/ER-CDH1細胞生長，該抑制作用呈濃度依賴性;H460/ER-CDH1與陰性對照細胞相比，對厄洛替尼的敏感度增加約6.1倍，IC50值分別為(7.51±1.12)μmol/L和(53.72±12.95)μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　11

18、、高表達E-cadherin后細胞EGFR基因蛋白水平上的變化
　　western blot結(jié)果顯示，EGFR、p-EGFR蛋白表達水平均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　本研究發(fā)現(xiàn):
　　NSCLC細胞在產(chǎn)生EGFR-TKIs耐藥的過程中出現(xiàn)了EMT。逆轉(zhuǎn)耐藥細胞的EMT可提高NSCLC對EGFR-TKIs的敏感性，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在NSCLC對EGFR-TKIs的獲得性耐藥中起重要作用