EGFR-TKIs通過下調黏附分子CD44表達抑制非小細胞肺癌的轉移.pdf

1、目的：肺癌是世界上發(fā)病率死亡率均居于首位的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌占所有肺癌的80-85％。異質性強、生物學行為復雜易于侵襲轉移是其主要特點，而易于遠處轉移進入晚期又是導致臨床治療失敗及患者死亡的最主要原因之一。近年，以表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）為代表的高效、低毒的分子靶向藥物在治療EG

2、FR突變的非小細胞肺癌領域取得了突破性進展，并被美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）推薦作為表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變晚期非小細胞肺癌治療的首選藥物。EGFR-TKI的主要作用機制是通過干預腫瘤細胞EGFR胞內區(qū)的酪氨酸激酶結構域，阻止其異常活化，進而阻斷下游信號轉導，發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖、促進

3、腫瘤細胞凋亡等作用。然而臨床效果觀察發(fā)現(xiàn)，部分服用EGFR-TKI的患者不僅腫瘤生長受到抑制，其整體轉移趨勢也受到影響。這就提示EGFR-TKI可能不僅作用于腫瘤細胞本身，很可能還通過某種潛在途徑調節(jié)腫瘤微環(huán)境，進而對腫瘤轉移產生影響，但具體機制目前還尚不明了。
　　黏附分子CD44是腫瘤微環(huán)境中黏附分子家族重要成員之一，其可介導細胞與細胞之間、細胞與基質之間的黏附作用，并通過參與一系列信號轉導為腫瘤轉移提供足夠動力。從頭頸部腫瘤

4、、乳腺癌等的研究結果中發(fā)現(xiàn)，EGFR信號通路與CD44之間可能存在著某種交叉協(xié)同關系，并在腫瘤轉移中發(fā)揮重要作用，但二者在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中是否也存在這種交互作用并對轉移產生影響以及具體機制目前還不清楚。遂本研究的目的即通過多種體外實驗方法探討在EGFR突變的NSCLC細胞系中，EGFR-TKI抑制腫瘤轉移的機制是否與下調黏附分子CD44表達有關，并初步探索連接二者信號通路

5、的關鍵信號分子。此研究不僅有利于我們對信號通路產生更深入的認識，更為未來尋找更多抑制轉移的新藥尋求靶點。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng)使用含15%胎牛血清、100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HCC827細胞（EGFR19外顯子突變肺腺癌細胞）和A549細胞（EGFR野生型肺腺癌細胞），置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，隔天換液，細胞長至80%以上處于對數(shù)生長期時進行實驗。
　

6、　2.采用實時無標記細胞增殖實驗方法分別檢測HCC827細胞（EGFR突變型）和A549細胞（EGFR野生型）對EGFR-TKI代表藥物厄洛替尼的敏感性，進一步確定實驗用細胞。
　　3.四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測不同濃度厄洛替尼對HCC827的增殖抑制作用。在加入相應濃度藥物的同時并加入合適濃度（50ng/ml）的EGF刺激因子，以模擬人體內環(huán)境，藥物作用48h后計算細胞增殖抑制率及半數(shù)抑制濃度（IC50），做出增殖抑制率曲線

7、。
　　4.采用Transwell小室侵襲實驗及劃痕實驗分別觀察四組（control、EGF（50ng/ml）刺激組、厄洛替尼（0.3μM）+EGF（50ng/ml）處理組、CD44中和抗體（20μg/ml）+EGF（50ng/ml）處理組）腫瘤細胞侵襲及遷移能力的變化情況。
　　5.采用流式細胞術檢測三組（control、EGF（50ng/ml）刺激組、厄洛替尼（0.3μM）+EGF（50ng/ml）處理組）腫瘤細胞表面C

8、D44表達情況。
　　6.采用Western-blot實驗方法檢測三組（control、EGF（50ng/ml）刺激組、厄洛替尼（0.3μM）+EGF（50ng/ml）處理組）腫瘤細胞CD44蛋白表達水平變化。
　　7.采用qRT-PCR實驗技術檢測三組（control、EGF（50ng/ml）刺激組、厄洛替尼（0.3μM）+EGF（50ng/ml）處理組）腫瘤細胞CD44mRNA的表達水平變化。
　　8.采用West

9、ern-blot實驗方法檢測四組（control、EGF（50ng/ml）刺激組、厄洛替尼（0.3μM）+EGF（50ng/ml）處理組、STAT3阻斷劑（S3I-20150μM）+EGF（50ng/ml）處理組）細胞CD44、STAT3、磷酸化STAT3蛋白表達水平。
　　9.統(tǒng)計學方法：采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量數(shù)據(jù)以x±s或M±QR表示，組間比較以單因素方差分析或秩和檢驗進行統(tǒng)計分析，LSD法進行各組間兩

10、兩比較，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.實時無標記細胞增殖實驗結果如Fig.1所示：EGFR-TKI代表藥物厄洛替尼（0.3μM）對EGFR突變的非小細胞肺癌細胞系HCC827具有較強的增殖抑制作用，并呈現(xiàn)時間依賴性；而對EGFR野生型的肺腺癌細胞系A549幾乎不產生作用；遂選定HCC827進行后續(xù)實驗。
　　2.MTT法檢測不同濃度厄洛替尼對HCC827細胞的增殖抑制作

11、用，結果顯示：隨著藥物濃度增大（0.001、0.01、0.1、0.5、1、10μM），厄洛替尼作用HCC827細胞48h后的增殖抑制率也逐漸增高，且呈劑量依賴性（Fig.2、Table1，P＜0.05）。結合細胞增殖抑制率，采用直線回歸方法得出IC50為0.323μM；
　　3.Transwell侵襲實驗結果如Fig.3、Fig.4和Table2所示：control、EGF刺激組、厄洛替尼+EGF處理組、CD44中和抗體+EGF處

12、理組穿膜細胞數(shù)分別為（64.07±1.51）個、（129.53±4.20）個、（21.0±1.06）個、（23.87±1.70）個；實驗組與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；劃痕實驗結果如Fig.5、Fig.6和Table3所示：各組細胞遷移距離分別為（78.65±3.19）μm、（119.98±1.62）μm、（51.73±4.23）μm、（53.18±6.71）μm；實驗組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；結

13、果證明厄洛替尼可抑制HCC827細胞的侵襲遷移能力。
　　4.流式細胞術檢測三組（control、EGF（50ng/ml）刺激組、厄洛替尼（0.3μM）+EGF（50ng/ml）處理組）HCC827細胞表面CD44表達水平分別為（25.87±3.46）%、（48.37±2.21）%、（15.50±1.11）%；結果顯示加入厄洛替尼后細胞表面CD44表達顯著低于前兩組，差異有統(tǒng)計學意義（Fig.7、Table4，P＜0.05）；

14、r>　　5.Western-blot方法檢測三組（同4）腫瘤細胞CD44蛋白半定量結果分別為（0.72±0.03）、（0.83±0.04）、（0.21±0.03），加入厄洛替尼組CD44蛋白表達顯著低于對照組和EGF刺激組，差異有統(tǒng)計學意義（Fig.8、Table5，P＜0.05）；結果從蛋白水平進一步證明厄洛替尼可下調CD44表達。
　　6.qRT-PCR法檢測三組（同4）腫瘤細胞CD44 mRNA表達變化：設對照組為1，EGF

15、刺激組及厄洛替尼+EGF處理組CD44 mRNA表達量分別是對照組的（2.22±0.17）倍和（0.50±0.04）倍；差異有統(tǒng)計學意義（Fig.9、Table6，P＜0.05）；實驗結果從基因水平上再次證明厄洛替尼可下調CD44表達。
　　7.Western-blot方法檢測四組（control、EGF（50ng/ml）刺激組、厄洛替尼（0.3μM）+EGF（50ng/ml）處理組、STAT3阻斷劑（S3I-20150μM）+E

16、GF（50ng/ml）處理組）腫瘤細胞CD44、STAT3、磷酸化STAT3蛋白表達水平，結果如Fig.10、Fig.11、Fig.12和Table7所示：與對照組比較，厄洛替尼組CD44和p-STAT3蛋白表達水平均被顯著下調（P＜0.05），而在使用STAT3特異性阻斷劑阻斷STAT3信號通路后CD44蛋白表達仍被下調（P＜0.05）；綜合以上結果初步得出，厄洛替尼阻斷EGFR信號通路的同時，其間接下調黏附分子CD44表達很可能是通

17、過EGFR/STAT3信號通路進行的，但其深入機制還需進一步探索。
　　結論：
　　1.HCC827細胞對EGFR-TKI代表藥物厄洛替尼高度敏感，適合作為本實驗用細胞。
　　2.EGFR-TKI藥物不僅可顯著抑制EGFR突變NSCLC細胞株HCC827細胞的增殖，還對其侵襲轉移能力產生明顯影響，并可能與CD44被下調有關。
　　3.EGFR-TKI藥物可明顯下調黏附分子CD44表達，且可能與EGFR/STAT3