大腸埃希菌臨床流行株整合子——基因盒系統(tǒng)的研究.pdf

1、背景： 抗菌藥物的大量及不合理使用，使得細菌在抗生素選擇壓力下耐藥菌株不斷產(chǎn)生，其中細菌通過基因的水平轉(zhuǎn)移，獲得外源性耐藥基因是加快臨床耐藥菌株產(chǎn)生的重要原因。與細菌耐藥基因水平轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的遺傳結(jié)構(gòu)有質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合型噬菌體以及近年來在細菌中發(fā)現(xiàn)的一種天然克隆表達系統(tǒng)--整合子(integron)。整合子通過位點特異性重組捕獲外源性基因盒(gene cassttes)并使之表達，同時整合子可位于質(zhì)粒上，或自身作為轉(zhuǎn)座子的一個

2、組成部分而參與轉(zhuǎn)移，使耐藥基因發(fā)生菌屬內(nèi)和菌屬間的播散。整合子因其在細菌耐藥基因水平轉(zhuǎn)移中的重要作用而受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注。 目的： 本研究旨在調(diào)查大腸埃希菌臨床耐藥株中整合子種類及分布，分析整合子與這些細菌耐藥和多重耐藥的關(guān)系，分析本地區(qū)耐藥菌株中整合子的演變，并進一步探討整合子參與這些菌株耐藥和多重耐藥的分子機制。 材料與方法： 1.收集本地區(qū)臨床分離的大腸埃希菌，采用紙片擴散法及二倍平板稀釋法測定

3、其藥物敏感性和測定MIC值，細菌總DNA抽提試劑盒提取細菌總DNA，改良堿裂解法提取細菌質(zhì)粒DNA； 2.采用整合酶基因PCR法檢測整合子陽性率； 3.按ESBLs檢測結(jié)果，將大腸埃希菌分為整合子陽性組和整合子陰性組，分析整合子與這些細菌耐藥和多重耐藥的關(guān)聯(lián)； 4.采用整合子PCR法擴增整合子可變區(qū)，聯(lián)合DNA測序技術(shù)進行可變區(qū)耐藥基因盒分析。 結(jié)果： 1.本地區(qū)大腸埃希菌中整合子的檢出率為59.

4、0％(309/524)，其中，Ⅰ類整合子的檢出率為58.4％(306/524)，Ⅱ類整合子的檢出率為0.57％(3/524)，未檢出Ⅲ類整合子； 2.將大腸埃希菌分為ESBLs陰性組和陽性組，分析兩組菌對氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類和喹諾酮類等臨床常用抗生素藥物敏感性，陽性組顯著高于陰性組； 3.在Ⅰ類整合酶基因擴增陽性的菌株中，大腸埃希菌整合子可變區(qū)擴增陽性率為89％，擴增片段大小從0.75kb到2.2kb不等。在Ⅱ類整合

5、酶基因擴增陽性的菌株中，3株可變區(qū)擴增陽性，大小均為0.75kb； 4.對Ⅰ類整合子可變區(qū)進行序列分析提示其含有：氨基糖苷類抗生素耐藥基因(aadA1、aadA5)、磺胺類耐藥基因(dfrA1，dfrA17)、氯霉素耐藥基因(cmlA)和功能不清的開放閱讀框(orfF)。Ⅱ類整合子可變區(qū)僅含有aadA基因，編碼氨基糖苷類抗生素的耐藥性，區(qū)別于其他腸桿菌科細菌如沙門、志賀菌中以及霍亂弧菌所檢出的Ⅱ類整合子特征； 5.本研究

6、中所檢測整合子大部分存在于細菌質(zhì)粒上，少數(shù)存在于細菌染色體上，并有極少數(shù)菌株含有2個及以上整合子結(jié)構(gòu)，分別存在于質(zhì)粒及細菌染色體上。 結(jié)論： 1.整合酶基因PCR法是進行整合子檢測的可靠而理想的方法，整合子PCR法聯(lián)合DNA測序技術(shù)是進行整合子可變區(qū)耐藥基因分析的一種快速、較準(zhǔn)確的方法； 2.Ⅰ類整合子廣泛存在于本地區(qū)腸桿菌科細菌中，Ⅱ類整合子檢出率低，主要存在于大腸埃希菌中； 3.腸桿菌科細菌對氨基糖苷

7、類、β-內(nèi)酰胺類和喹諾酮類等抗生素和多重耐藥與Ⅰ類整合子的存在明顯相關(guān)，整合子可作為細菌耐藥的一種標(biāo)記，用于檢測細菌耐藥情況； 4.整合子可變區(qū)主要含有編碼對氨基糖苷類和磺胺類抗生素耐藥的基因，并含有少量的氯霉素耐藥基因和功能不清的開放閱讀框，整合子參與了腸桿菌科細菌的耐藥和多重耐藥； 5.整合子可變區(qū)中的耐藥基因?qū)毦退幮缘男纬捎兄匾饔茫狙芯恐兴鶛z測整合子大部分存在于細菌質(zhì)粒上，少數(shù)存在于細菌染色體上，并有極少數(shù)