腦脊液?jiǎn)魏思?xì)胞內(nèi)PPD和ESAT-6抗原檢測(cè)對(duì)結(jié)核性腦膜炎診斷價(jià)值的探討.pdf

1、目的:結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis,TBM),約占肺外結(jié)核的7-10％[1],是由結(jié)核桿菌引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病,致殘率和致死率較高,其預(yù)后與早期診斷及時(shí)治療密切相關(guān)。但結(jié)腦的診斷,尤其是早期診斷比較困難,因?yàn)榻Y(jié)腦患者的腦脊液(CSF)中結(jié)核桿菌的數(shù)量很少,腦脊液涂片抗酸染色陽(yáng)性率很低約為10％,而結(jié)核菌培養(yǎng)所需時(shí)間(4～8周)較長(zhǎng),且陽(yáng)性率僅20～30％[2],對(duì)臨床早期診斷價(jià)值有限。相關(guān)性研究表明

2、結(jié)核抗原存在可以作為結(jié)核菌存在的證據(jù)[3],因而檢測(cè)腦脊液(cerebrospinal fluid CSF)中的結(jié)核抗原對(duì)TBM的診斷很有價(jià)值。免疫組化法檢測(cè)腦脊液?jiǎn)魏思?xì)胞內(nèi)結(jié)核菌素純蛋白衍生物(protein purifiedderivative,PPD)實(shí)驗(yàn),對(duì)臨床診斷TBM具有一定的參考價(jià)值,但此抗原尚有一些不足之處。PPD為成分不明確的復(fù)合抗原(多克隆),存在一定的假陰性和假陽(yáng)性,因此尋找一種獨(dú)特的抗原對(duì)TBM的診斷非常必要。早

3、期分泌性抗原靶6(6Kd early secretory antigenic target,ESAT-6)為結(jié)核分枝桿菌感染早期所分泌的蛋白,具有高度的分布特異性和良好的免疫原性,當(dāng)結(jié)核桿菌在感染的單核巨噬細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)時(shí),ESAT-6抗原表達(dá)量明顯提高,因此采用單克隆抗體(免疫組化法)檢測(cè)腦脊液?jiǎn)魏思?xì)胞內(nèi)ESAT-6可能會(huì)增加診斷結(jié)腦的敏感性和特異性。本課題研究的目的是將ESAT-6與PPD對(duì)結(jié)核性腦膜炎的診斷價(jià)值進(jìn)行比較,為結(jié)核性腦膜炎

4、的診斷提供有效的方法。
　　 方法:將2009年1月～2009年7月神經(jīng)內(nèi)科住院的40例病人分為兩組,一組為結(jié)腦組:入選標(biāo)準(zhǔn)參考Ahuja[3]的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn),共20例,男8例,女12例,年齡2-59歲,中位值年齡24.5歲,其中單純結(jié)腦16例,合并顱外結(jié)核者4例。另一組為對(duì)照組:共20例,男9例,女11例,年齡1-59歲,中位值年齡26歲。根據(jù)第五版神經(jīng)病學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)入選,其中化膿性腦膜炎5例,新型隱球菌腦膜炎2例,病毒性腦膜炎

5、8例,腦囊蟲病1例,腦腫瘤2例(聽神經(jīng)瘤1例,肺癌腦轉(zhuǎn)移1例),脊髓炎1例,布氏桿菌病1例。對(duì)所有患者均進(jìn)行腦脊液常規(guī)、生化、細(xì)胞學(xué)檢查(MGG染色)和阿利新蘭染色。取腦脊液1ml,用Therm-4 ShandonCytospin型玻片離心機(jī)(購(gòu)自英國(guó))離心玻片3張,用免疫組化的方法檢測(cè)單核細(xì)胞內(nèi)的PPD和ESAT-6抗原。將沉淀有細(xì)胞的玻片放入中性甲醛中固定10分鐘,然后用蒸餾水沖洗,0.01MPBS浸泡5分鐘,3％H2O2去離子水孵

6、育10分鐘,以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。滴加封閉用山羊血清工作液室溫孵育15分鐘傾去。一張玻片滴加適當(dāng)比例稀釋的單克隆鼠抗人ESAT-6抗體(購(gòu)自美國(guó)ADL公司),另一張滴加兔抗結(jié)核分枝桿菌多克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)Abcom公司),以PBS緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照。4℃冰箱孵育過夜。PBS沖洗3次每次3分鐘。滴加生物素化二抗(購(gòu)自中杉金橋公司)工作液室溫孵育15分鐘,PBS沖洗3次,每次3分鐘,滴加辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液,37℃孵育1

7、5分鐘,PBS沖沈3次每次3分鐘,顯色劑顯色(DAB)5分鐘,流水沖洗10分鐘。蘇木素染色3分鐘,自來水沖洗浮色。光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS-BX41日本)下觀察,腦脊液圖文分析儀(MCDS-2020重慶)采圖判讀結(jié)果,單核細(xì)胞胞漿呈棕色為陽(yáng)性結(jié)果,單核細(xì)胞胞漿無(wú)色為陰性結(jié)果。
　　 結(jié)果:
　　 1臨床資料:結(jié)腦組患者發(fā)熱及意識(shí)障礙發(fā)生率分別為100％,65％,對(duì)照組為70％,25％,兩組之間差異顯著,而頭痛、惡心嘔吐

8、、顱高壓、腦膜刺激征、腦局灶體征、腦電圖兩組無(wú)明顯差別。
　　 2腦脊液常規(guī)、生化:結(jié)腦組白細(xì)胞數(shù)3～14000個(gè)/mm3,平均為952.5±3086個(gè)/mm3,糖0.8～4.1 mmol/L,平均為1.76±0.735mmol/L;蛋白含量0.61～2.39 g/L,平均為1.35±0.53/L;氯化物96～122.4 mmol/L,平均為110.9±8.46mmol/L;對(duì)照組細(xì)胞數(shù)0～2980個(gè)/mm3,平均為
　　

9、 3.52±717.02個(gè)/mm3;糖0.09～4.7 mmol/L,平均為2.866±1.089 mmol/L;蛋白0.08±4.95 g/L,平均為0.973±1.356 g/L,氯化物由106～142.0mmol/L,平均為120.96±9.45 mmol/L。結(jié)腦組較對(duì)照組糖和氯化物明顯降低,而白細(xì)胞數(shù)和蛋白無(wú)明顯差別。
　　 3細(xì)胞學(xué)表現(xiàn):結(jié)腦組腦脊液細(xì)胞學(xué)20例全部為混合細(xì)胞反應(yīng),均未見腫瘤細(xì)胞且阿利新蘭染色陰性。

10、對(duì)照組中混雜細(xì)胞學(xué)9例,淋巴樣細(xì)胞反應(yīng)5例,正常細(xì)胞學(xué)反應(yīng)2例,激活單核細(xì)胞樣細(xì)胞學(xué)反應(yīng)2例,中性粒細(xì)胞反應(yīng)2例,隱球菌腦膜炎者細(xì)胞學(xué)及阿利新蘭染色均找到隱球菌。腦囊蟲病嗜酸性粒細(xì)胞明顯增多。腫瘤患者找到腫瘤細(xì)胞且激活單核細(xì)胞增多。在動(dòng)態(tài)觀察中顯示結(jié)腦病人隨治療好轉(zhuǎn)中性粒細(xì)胞逐漸減少,但持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間,同時(shí)激活的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞逐漸增加,漿細(xì)胞出現(xiàn),這與結(jié)腦動(dòng)態(tài)變化相符。
　　 4單核細(xì)胞內(nèi)ESAT-6抗原:可在腦脊液中檢測(cè)到單

11、核細(xì)胞內(nèi)的ESAT-6,大多數(shù)單核細(xì)胞都有較強(qiáng)的胞漿染色,且多次檢測(cè)可持續(xù)陽(yáng)性,激活單核細(xì)胞較少染色或染色較淺。20例TBM患者中14例ESAT-6抗原陽(yáng)性,6例陰性,對(duì)照組中僅1例病毒性腦膜炎患者陽(yáng)性,此方法診斷TBM敏感性為70％,特異性為95％,約登指數(shù)0.65。在20例TBM病人中,最早發(fā)病5天,最晚發(fā)病120天可檢測(cè)出胞內(nèi)ESAT-6。
　　 5單核細(xì)胞內(nèi)PPD抗原:20例TBM患者中13例PPD抗原陽(yáng)性,7例陰性,對(duì)

12、照組中2例病毒性腦膜炎患者陽(yáng)性,18例陰性。此方法診斷TBM敏感性為65％,特異性為90％,約登指數(shù)0.55。
　　 6 ESAT-6及PPD診斷TBM比較:敏感性P＞0.05,特異性P＞0.05,二者之間敏感性和特異性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論:
　　 1結(jié)腦患者臨床表現(xiàn)較重,常伴有發(fā)熱及意識(shí)障礙。結(jié)腦患者臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣與其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病較難鑒別。
　　 2腦脊液生化可為結(jié)腦診斷提供一定依據(jù),但腦脊

13、液常規(guī)意義較小。
　　 3腦脊液細(xì)胞學(xué)對(duì)結(jié)腦的診斷和鑒別診斷具有重要參考價(jià)值。
　　 4結(jié)腦患者腦脊液?jiǎn)魏思?xì)胞內(nèi)存在ESAT-6抗原。TBM組與對(duì)照組比較ESAT-6陽(yáng)性率差異顯著,說明該方法對(duì)診斷和鑒別診斷TBM方面有意義。
　　 5檢測(cè)單核細(xì)胞內(nèi)單克隆ESAT-6抗原與檢測(cè)單核細(xì)胞內(nèi)多克隆PPD抗原相比其敏感性、特異性無(wú)顯著差別,可能是病例數(shù)少所致。但ESAT-6抗原的約登指數(shù)高于PPD抗原的檢測(cè),兩種方法的