兩型TNF-α及其受體在小鼠心肌肥厚中作用及其機制.pdf

1、研究背景和目的：
　　心力衰竭（Heart Failure，HF）是指由于各種病因所引起的心室收縮（舒張）功能下降、射血功能障礙，從而使心排血量不能滿足機體代謝的需要，器官、組織血液灌注不足引起的一些列臨床綜合征。在發(fā)達國家中，有近1-2％的成年人患有心力衰竭，在70歲以上的人群中，其發(fā)病率可以高達10％。而心力衰竭晚期的5年死亡率高達50％，其惡性程度不低于癌癥和艾滋病。心肌肥厚是心臟為適應(yīng)各種刺激而產(chǎn)生的心肌細胞體積增大，重量

2、增加，是心力衰竭過程中早期代償關(guān)鍵階段。目前研究認為，引起心肌肥厚的主要機制有，機械性與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)激活，慢性炎癥反應(yīng)激活等。了解心力衰竭的機制，特別是心肌肥厚向心力衰竭轉(zhuǎn)變的過程，對于人們認識心力衰竭以及在臨床中提供新的治療策略有著重要的意義。
　　心力衰竭發(fā)生發(fā)展的過程是一個伴隨慢性炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的病理過程。炎癥細胞因子常在心力衰竭病人體內(nèi)高表達，其通過影響心肌收縮力，引起心肌肥大，誘導(dǎo)心肌纖維化和凋亡，促進心臟重構(gòu)等作用

3、促進心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。其中，瘤壞死因子（Tumor necrosis factoralpha，TNF-α）就是眾多炎癥因子的關(guān)鍵因子之一。自從1990年Levine等人發(fā)現(xiàn)炎癥因子TNF-α在心力衰竭患者體內(nèi)表達量明顯升高之后，研究人員圍繞TNF-α對心力衰竭的影響進行了大量深入的研究，證實TNF-α及其受體在心肌肥厚和心力衰竭過程中扮演了重要的角色。其中目前公認的TNF-α對心肌主要影響包括：干擾細胞Ca2+內(nèi)流，激活一氧化氮合酶(

4、NOS)，升高局部NO水平，抑制心肌收縮力；激活基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和抑制基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)的表達參與細胞外基質(zhì)重塑；TNF-α與TNF-αR1或Fas結(jié)合后,激活細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)心肌細胞凋亡等。鑒于TNF-α對心肌眾多負性調(diào)節(jié)作用，抗腫瘤壞死因子治療方案也用于實驗和臨床研究。然而，通過10年的研究，雖然抗腫瘤壞死因子治療在發(fā)生心力衰竭的大鼠和小鼠中被證明是有效的，但是在上世紀末、本世紀初進行的TNF-α

5、拮抗劑治療心力衰竭病人的隨機、雙盲大規(guī)模臨床試驗中卻沒有出現(xiàn)明顯的效果，甚至提高了心力衰竭患者的住院率和死亡率。所以對TNF-α進行更深入、更細致的研究對于了解炎癥因子在心力衰竭中的作用機制以及解決抗炎治療在臨床中的問題具有重要意義。
　　本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 不同TNF-α受體對壓力負荷誘導(dǎo)所致心肌肥厚小鼠的作用及其機制
　　實驗?zāi)康模禾接懺诓煌琓NF-α受體在壓力負荷誘導(dǎo)所致心肌肥厚小鼠的

6、作用及其機制
　　實驗方法：
　　1.本實驗通過使用胸主動脈縮窄手術(shù)方法誘導(dǎo)壓力負荷性小鼠心力衰竭模型。以野生型小鼠為對照，在手術(shù)后2周觀察該心力衰竭模型在不同TNF-α受體敲除小鼠（TNFR1敲除小鼠，TNFR2敲除小鼠，TNFR1/2雙敲除小鼠）所出現(xiàn)的心肌肥厚進展情況。檢測各個組中小鼠心臟形態(tài)、功能、血流動力學(xué)改變，炎癥因子變化情況，并對心肌肥厚相關(guān)信號通路進行檢測，以明確與不同TNF-α受體相關(guān)的關(guān)鍵信號通路。

7、>　　2.使用AngII誘導(dǎo)H9c2（2-1）心肌細胞肥大，分別轉(zhuǎn)染相關(guān)TNF-α受體siRNA檢測其對心肌細胞肥大的作用機制及相關(guān)信號通路，證實體內(nèi)試驗并予以阻斷關(guān)鍵通路以檢測其能否達到改善心肌肥大的效果。
　　實驗結(jié)果：
　　1.不同TNF-α受體在胸主動脈縮窄誘導(dǎo)的壓力負荷性心肌肥厚中介導(dǎo)不同的效應(yīng)，也就是TNFR1可以加重心肌肥厚程度、加重心臟收縮舒張功能障礙，TNFR2可以減輕心肌肥厚程度、改善心臟收縮舒張功能。<

8、br>　　2.在胸主動脈縮窄誘導(dǎo)的壓力負荷性心肌肥厚中兩種TNF-α受體表達量均增加，但是TNFR1升高程度要高于TNFR2升高程度。
　　3.兩種TNF-α受體在胸主動脈縮窄誘導(dǎo)的壓力負荷性心肌肥厚中介導(dǎo)不同的炎癥反應(yīng)，通過TNFR1促進促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6等）減少抗炎因子（IL-10）表達，反之，TNFR2可以降低促炎因子表達，增強抗炎因子表達。
　　4.不同TNF-α受體介導(dǎo)不同心肌肥大相關(guān)信號通

9、路。
　　5.用siRNA沉默TNFR1表達可以減輕血管緊張素誘導(dǎo)的心肌細胞肥大，用siRNA沉默TNFR2可以加重血管緊張素誘導(dǎo)心肌細胞肥大。
　　6.TNFR1可以通過NFκB活化誘導(dǎo)心肌細胞肥大，而TNFR2可以通過激活A(yù)KT信號通路達到保護心肌細胞的作用。
　　第二部分 兩型TNF-α與不同TNF-α受體對壓力負荷誘導(dǎo)所致心肌肥厚小鼠的作用及其機制
　　實驗?zāi)康模禾接懣缒Ｐ秃头置谛蚑NF-α與不同TNF-

10、α受體在壓力負荷誘導(dǎo)所致心肌肥厚小鼠的作用及其機制
　　實驗方法：
　　1.在胸主動脈縮窄手術(shù)方法誘導(dǎo)壓力負荷性不同TNF-α受體敲除小鼠心力衰竭模型中使用Alzet微量注射泵，給予TNF-α轉(zhuǎn)化酶（TNF-α-converting enzyme，TACE）抑制劑TAPI-1，以減少tmTNF-α向sTNF-α轉(zhuǎn)變。觀察tmTNF-α高表達時在不同TNF-α受體敲除小鼠中對心肌肥厚的作用和影響，了解tmTNF-α與兩種受體相

11、互關(guān)系，并找出相關(guān)信號通路。
　　2.在體外使用sTNF-α干預(yù)轉(zhuǎn)染相關(guān)TNF-α受體siRNA的H9c2（2-1）心肌細胞模擬高水平sTNF-α與不同受體相互關(guān)系及其對心肌細胞的作用和影響；使用高表達tmTNF-α的NIH3T3細胞與轉(zhuǎn)染相關(guān)TNF-α受體siRNA的H9c2（2-1）心肌細胞共培養(yǎng)，模擬高水平tmTNF-α與不同受體相互關(guān)系及其對心肌細胞的作用和影響。檢測細胞增殖和凋亡相關(guān)通路，證實不同類型TNF-α和不同TN

12、F-α受體相互關(guān)系，以及其對心肌細胞的作用和影響。
　　實驗結(jié)果：
　　1.在胸主動脈縮窄誘導(dǎo)的心肌肥厚模型中，tmTNF-α和sTNF-α表達和分泌量均有增加。
　　2.使用微量注射泵給予TACE抑制劑TAPI-1抑制tmTNF向sTNF轉(zhuǎn)變可以緩解胸主動脈縮窄誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚程度。這種效應(yīng)在野生型、TNFR1和TNFR2敲除小鼠中均可以檢測到，但是在TNFR2敲除小鼠中效應(yīng)更明顯。
　　3.通過體外試驗，證明

13、了sTNF主要通過TNFR1介導(dǎo)心肌細胞胞毒效應(yīng)和誘導(dǎo)心肌細胞凋亡，而tmTNF可以通過TNFR2減少心肌細胞凋亡和保護心肌的作用。
　　第三部分 初步探討骨髓來源抑制性細胞（myeloid-drived suppressor cells，MDSC）對壓力負荷誘導(dǎo)所致心肌肥厚小鼠的作用
　　實驗?zāi)康模禾接慚DSC在心力衰竭患者及心肌肥厚小鼠中的作用及機制
　　實驗方法：
　　1.通過流式細胞術(shù)檢測心力衰竭患者外周

14、血中MDSC比例，證實MDSC與心力衰竭之間的關(guān)系。在不同TNFR敲除小鼠建立胸主動脈縮窄術(shù)誘導(dǎo)心肌肥厚，并通過流式細胞術(shù)檢測外周血、脾臟和心肌組織中MDSC變化情況。
　　2.在體外將不同類型MDSC進行分離和純化，將其與心肌細胞直接或間接共同培養(yǎng)，并檢測其對血管緊張素誘導(dǎo)心肌細胞肥大影響和機制。
　　實驗結(jié)果：
　　1.心力衰竭患者外周血中MDSC數(shù)量隨著心力衰竭程度加重而升高。
　　2.胸主動脈縮窄誘導(dǎo)心肌

15、肥厚小鼠外周血、脾臟和心肌組織中MDSC比例均有增加，但TNFR1敲除小鼠MDSC增加比例最多。
　　3.通過體外MDSC與心肌細胞直接或間接共培養(yǎng)證明，MDSC與心肌細胞直接接觸時可以通過增加IL-10表達減輕血管緊張素誘導(dǎo)的心肌細胞肥大，且表達TNFR2的MDSC IL-10表達量更高，抗心肌肥厚功能更強。
　　統(tǒng)計學(xué)分析
　　計量資料數(shù)據(jù)均以均值±標準誤表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組均數(shù)比較選

16、擇t檢驗，對3組以上均數(shù)進行組間比較，用單因素方差分析（ANOVA），p<0.05則認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.在胸主動脈縮窄誘導(dǎo)的壓力負荷性心肌肥厚中tmTNF、sTNF及其TNF-α受體表達量均增加，但是TNFR1升高程度要高于TNFR2升高程度。
　　2.不同TNF-α受體在胸主動脈縮窄誘導(dǎo)的壓力負荷性心肌肥厚中介導(dǎo)不同的效應(yīng)：TNFR1可以加重心肌肥厚程度、加重心臟收縮舒張功能障礙，TNFR2可

17、以減輕心肌肥厚程度、改善心臟收縮舒張功能。
　　3.兩種TNF-α受體在胸主動脈縮窄誘導(dǎo)的壓力負荷性心肌肥厚中介導(dǎo)不同的炎癥反應(yīng)，通過TNFR1促進促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6等）減少抗炎因子（IL-10）表達，反之，TNFR2可以降低促炎因子表達，增強抗炎因子表達。
　　4.不同TNF-α受體介導(dǎo)不同心肌肥大相關(guān)信號通路。
　　5.siRNA沉默TNFR1表達可以減輕血管緊張素誘導(dǎo)的心肌細胞肥大，用si

18、RNA沉默TNFR2可以加重血管緊張素誘導(dǎo)心肌細胞肥大。
　　6.TNFR1可以通過NFκB活化誘導(dǎo)心肌細胞肥大，而TNFR2可以通過激活A(yù)KT信號通路達到保護心肌細胞的作用。
　　7.抑制tmTNF向sTNF轉(zhuǎn)變可以緩解胸主動脈縮窄誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚程度。尤其是在TNFR2敲除小鼠中效果更明顯。
　　8.sTNF主要通過TNFR1介導(dǎo)心肌細胞胞毒效應(yīng)和誘導(dǎo)心肌細胞凋亡，而tmTNF可以通過TNFR2減少心肌細胞凋亡和保