丹參酮ⅡA對(duì)心肌肥厚的防治作用及其機(jī)制探討.pdf

1、第一章腹主動(dòng)脈縮窄性大鼠心肌肥厚病變及丹參酮ⅡA的干預(yù)作用　　目的： 已知氧化損傷參與了壓力超負(fù)荷引起的心肌肥厚等病理過程，在心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展中都起重要作用。傳統(tǒng)中藥丹參的主要脂溶性單體丹參酮ⅡA是一種有效的抗氧化劑，本實(shí)驗(yàn)通過建立腹主動(dòng)脈縮窄性大鼠模型，觀察壓力超負(fù)荷模型大鼠心肌肥厚和心肌纖維化病變，研究丹參酮Ⅱ A是否對(duì)這些病變具有改善作用及其作用的可能機(jī)制。 方法： 采用腹主動(dòng)脈縮窄法(AAC)建立

2、心肌肥厚模型。健康SD雄性大鼠50只，體重190-210g，隨機(jī)取40只造模，余下10只做假手術(shù)。造模結(jié)束后一周，存活的35只手術(shù)組大鼠隨機(jī)分為三組：模型組(AAc，n=13)，灌胃給予0.5％羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)：模型加丹參酮ⅡA高劑量組(TH，n=11)，灌胃給予丹參酮Ⅱ 結(jié)果： 1、大鼠AAC5周后，AoSP、AoDP、LVSP以及LVEDP顯著升高；±dp/dtmax也有一定增高，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這說明

3、AAC大鼠術(shù)后血壓明顯升高，并出現(xiàn)了心臟收縮、舒張功能的障礙，在體心功能下降。高劑量丹參酮ⅡA能顯著降低LVEDP，在一定程度上改善AAC大鼠心功能，糾正血流動(dòng)力學(xué)紊亂，但無明顯降血壓作用。低劑量丹參酮ⅡA對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的改善作用不明顯。 2、大鼠AAC5周后左心室重量與體重比值(LVW/BW)明顯增大；HE染色切片顯示模型組大鼠左心室呈明顯的向心性肥厚生長(zhǎng)，VG染色顯示心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)明顯增大。這些指數(shù)說明AAC大鼠術(shù)

4、后5周發(fā)生了明顯的心肌肥厚、心肌纖維化。丹參酮Ⅱ A能夠顯著抑制這些變化，并具有劑量依賴性。 3、檢測(cè)到AAC大鼠心肌中MDA濃度顯著升高；應(yīng)用共聚焦顯微鏡也檢測(cè)到AAC組大鼠心室肌中O2·-產(chǎn)生明顯增多，說明氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)。丹參酮ⅡA能夠劑量依賴性減弱心肌組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)。 4、RT-PCR和Western blot方法都顯示CTGF表達(dá)水平在AAC組大鼠明顯上調(diào)，丹參酮Ⅱ A劑量依賴性降低CTGF的表達(dá)。

5、 結(jié)論： 1、本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制腹主動(dòng)脈縮窄性心肌肥厚大鼠模型，觀察到血流動(dòng)力學(xué)紊亂及心功能受損的表現(xiàn)，伴有明顯的心肌纖維化發(fā)生。 　　2、腹主動(dòng)脈縮窄模型大鼠心肌處于強(qiáng)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，并伴有促纖維化細(xì)胞因子CTGF的表達(dá)上調(diào)。 3、丹參酮ⅡA能通過減輕氧化應(yīng)激狀態(tài)、下調(diào)CTGF表達(dá)，有效改善腹主動(dòng)脈縮窄大鼠的心功能失調(diào)及心肌纖維化程度，且呈劑量依賴性。但對(duì)血壓無明顯影響。 第二章丹參酮ⅡA對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)

6、胞凋亡的保護(hù)作用及分子機(jī)制　　目的： 心肌細(xì)胞在各種刺激下可發(fā)生凋亡，導(dǎo)致心肌細(xì)胞的丟失及繼發(fā)性成纖維細(xì)胞的增殖和瘢痕形成，最終導(dǎo)致心臟收縮和舒張功能受損，誘發(fā)心臟衰竭。氧化應(yīng)激是不同心血管疾病中誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡的主要因素。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡參與了臨床常用抗腫瘤藥阿霉素的心肌毒性作用，自由基清除劑可對(duì)抗阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。本研究的目的在于研究丹參酮Ⅱ A是否對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，并探討其可能

7、存在的分子機(jī)制。 結(jié)果： 1.在本實(shí)驗(yàn)中，1 μ M阿霉素作用于心肌細(xì)胞24h后，細(xì)胞存活率明顯下降，Hoechst染色顯示在正常心肌細(xì)胞核之間有散在分布的凋亡細(xì)胞核，流式細(xì)胞儀檢測(cè)到細(xì)胞凋亡峰的面積明顯增大。 2.丹參酮ⅡA預(yù)處理心肌細(xì)胞可劑量依賴性抑制阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率下降，Hoechst染色顯示的細(xì)胞凋亡百分率有明顯下降，流式細(xì)胞儀的定量檢測(cè)也得到類似結(jié)果。 3.1 μ M阿霉素作用于心肌細(xì)胞2

8、4h后，倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示細(xì)胞內(nèi)DCF和DHE熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，2 μ M丹參酮ⅡA預(yù)處理可減少阿霉素引起的心肌細(xì)胞活性氧產(chǎn)生。 4.1 μ M阿霉素明顯下調(diào)心肌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)并上調(diào)Bax表達(dá)水平，Bcl-2/Bax比值下降，2 μ M丹參酮ⅡA預(yù)處理可上調(diào)阿霉素引起的Bcl-2/Bax比值下降。 結(jié)論： 1、在本實(shí)驗(yàn)條件下，阿霉素引發(fā)體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋

9、亡。 2、丹參酮ⅡA劑量依賴性抑制阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，丹參酮ⅡA的心肌細(xì)胞保護(hù)作用至少部分是通過它的抗氧化能力而實(shí)現(xiàn)的。 第三章 AngⅡ?qū)w外培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響及丹參酮ⅡA的干預(yù)作用　　目的： 血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)是心肌膠原網(wǎng)絡(luò)重塑的重要促進(jìn)因子，循環(huán)和組織的Ang Ⅱ濃度增高，可促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大和間質(zhì)纖維化，從而參與了心肌重塑的病理過程。心臟成纖維細(xì)胞是心臟中數(shù)量最多的細(xì)胞，各

10、種原因?qū)е碌男呐K成纖維細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)合成過多可造成心肌纖維化的發(fā)生，體外研究心臟成纖維細(xì)胞具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制AngⅡ誘導(dǎo)的成年大鼠心臟成纖維細(xì)胞(CFbs)膠原表達(dá)的細(xì)胞模型，研究丹參酮ⅡA對(duì)CFbs細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響并探討其機(jī)制。 結(jié)果： 1、通過檢測(cè)3H標(biāo)記的脯氨酸(3H-proline)摻入發(fā)現(xiàn)，10-10M到10-6M Ang Ⅱ誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞膠原合成具有劑量依賴性，Ang Ⅱ在10-8M

11、時(shí)對(duì)膠原合成的誘導(dǎo)效果達(dá)到平臺(tái)期。 2、10-7M AngⅡ作用于CFbs 24h后顯著增加了3H-proline摻入量，2μ M和1μ M TSN預(yù)處理則劑量依賴性的抑制了Ang Ⅱ的作用。 3、10-M Ang Ⅱ使CTGF、FN和CollagenⅠI轉(zhuǎn)錄明顯增加，10 μ M纈沙坦(AT1R拮抗劑)使各基因轉(zhuǎn)錄恢復(fù)到接近基礎(chǔ)水平，說明Ang Ⅱ促進(jìn)CTGF、FN和CollagenⅠ轉(zhuǎn)錄的效果絕大部分是通過AT1受體

12、發(fā)揮的。2 μ M和1 μ M TSN預(yù)處理1h則劑量依賴性的抑制了AngⅡ的作用，其中2μ M TSN效果與10μ M纈沙坦相當(dāng)。 4、10-7M Ang Ⅱ作用CFbs 24h后使CTGF和FN蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，10 μ M纈沙坦使CTGF和FN蛋白表達(dá)恢復(fù)到接近基礎(chǔ)水平，說明Ang Ⅱ誘導(dǎo)的CTGF和FN蛋白表達(dá)的效果絕大部分是通過AT1受體發(fā)揮的。2 μ M和1 μ M TSN預(yù)處理1h則劑量依賴性的抑制了Ang Ⅱ的作

13、用，其中2μ M TSN效果與10 μ M纈沙坦效果相當(dāng)。 5、使用倒置熒光顯微鏡在正常情況下可以在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到少量紅色熒光，10-7MAngμ作用于細(xì)胞后，熒光明顯增強(qiáng)，2μ M和1 μ M TSN預(yù)處理都明顯抑制了Ang Ⅱ的作用，10 μ M纈沙坦可完全拮抗Ang Ⅱ的作用，使熒光強(qiáng)度恢復(fù)到正常水平。流式細(xì)胞儀檢測(cè)也得到了類似的結(jié)果。 結(jié)論： 1、體外成功復(fù)制了Ang Ⅱ促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞膠原表達(dá)增高的模型。

14、 2、丹參酮ⅡA劑量依賴性抑制Ang Ⅱ促進(jìn)CFbs細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的作用，該作用主要通過AT1受體介導(dǎo)，與抑制細(xì)胞膠原合成有關(guān)。 3、Ang Ⅱ可加強(qiáng)CFbs氧化應(yīng)激反應(yīng)并使CTGF表達(dá)上調(diào)，該作用主要通過AT1受體介導(dǎo)；丹參酮ⅡA可減輕Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激并下調(diào)CTGF的表達(dá)。 第四章 CTGF在Ang Ⅱ誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)心臟成纖維細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)合成中的表達(dá)變化、調(diào)控機(jī)制　　目的： CTGF是新近發(fā)現(xiàn)

15、的具有多種生物學(xué)功能的生長(zhǎng)因子，在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，尤其與纖維化性疾病關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)研究目的在于檢測(cè)CTGF在AngⅡ刺激的體外培養(yǎng)CFbs膠原合成過程中的表達(dá)變化，驗(yàn)證CTGF在此過程中是否具有關(guān)鍵性作用。之后探討ERK1/2磷酸化信號(hào)通路在CTGF表達(dá)調(diào)控中的作用。 結(jié)論： 1、Ang Ⅱ誘導(dǎo)CTGF表達(dá)具有隨時(shí)間和劑量變化的趨勢(shì)。 2、三對(duì)干擾序列中，stealth_1791(S1)