生物反應器內(nèi)成骨細胞的擴增和組織工程骨的構建.pdf

1、大連理工大學博士學位論文生物反應器內(nèi)成骨細胞的擴增和組織工程骨的構建姓名：宋克東申請學位級別：博士專業(yè)：化學工程指導教師：劉天慶崔占峰20060501生物反應器內(nèi)成骨細胞的擴增和組織工程骨的構建性能檢測，并對培養(yǎng)過程中的營養(yǎng)代謝情況進行分析。結果顯示，在RWHMB內(nèi)動態(tài)培養(yǎng)的成骨細胞生長良好，分泌大量的細胞外基質；中空纖維膜亦表現(xiàn)出良好的生物相容性。實驗結果證實RWHMB能結合RWVB和中空纖維膜的優(yōu)點，較好的模擬體內(nèi)環(huán)境，對所培養(yǎng)的細

2、胞施加適當?shù)牧黧w應力刺激，促進細胞的新陳代謝和物質交換，更有利于細胞的生長及增殖。利用擴增出的成骨細胞作為種子細胞，將其分別以2lO％ells／ml和1106cells／ml兩種密度接種到生物衍生骨支架材料上，在RWVB內(nèi)進行三維組織工程骨的構建。對所構建的骨組織分別進行倒置顯微鏡(InvertedMicroscope)、掃描電鏡(SEM)、堿性磷酸酶(舢LPl、礦化結構和AO／EB雙重熒光染色等生物學性能檢測，并對培養(yǎng)過程的營養(yǎng)物質代

3、謝情況進行監(jiān)控和分析。結果顯示以這兩種密度接種在RWVB中培養(yǎng)的骨組織生長良好，能分泌大量膠原纖維，并有礦化基質和新骨樣組織形成。通過RWVB內(nèi)部流體對流所產(chǎn)生的應力刺激，可提高成骨細胞堿性磷酸酶的活性表達，并加速礦化結節(jié)的形成，從而完成成骨細胞的快速增殖與分化以及工程化組織的三維構建。為進一步探索骨組織工程產(chǎn)業(yè)化的方法，用經(jīng)綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)標記的新西蘭兔顱骨來源的成骨細胞復合到生物

4、衍生骨支架材料上，在RWVB內(nèi)三維構建組織工程骨，同時與靜態(tài)培養(yǎng)環(huán)境中構建的組織工程骨進行比較。每12小時取樣一次，分別進行乳酸、葡萄糖、pH的測定，一周后取出標本通過掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡、組織學、免疫組織化學、流式細胞儀、細胞計數(shù)、染色體倍體分析等手段比較利用RWVB構建的組織工程骨與靜態(tài)培養(yǎng)構建的組織工程骨的差異。結果顯示RWVB中以兩種密度接種和構建的組織生長良好，細胞仍保持正常的細胞周期和染色體形態(tài)，并且RWVB中的構建物

5、的細胞擴增是靜態(tài)培養(yǎng)的5倍。研究結果進一步證實了骨組織工程產(chǎn)業(yè)化的現(xiàn)實可行性。對三維構建的組織工程骨修復新西蘭兔橈骨大段骨缺損進行了動物實驗研究。制作新西蘭兔橈骨中段15mm骨缺損實驗模型，隨機分為實驗組、對照組和空白組，實驗組植入經(jīng)RWVB構建的組織工程骨、對照組植入靜態(tài)培養(yǎng)環(huán)境中構建的組織工程骨、空白組僅植入空白的生物衍生骨支架材料。術后對動物進行大體觀察、x攝線觀察各組不同時期骨缺損的修復情況，并于術后4周和8周取出骨缺損區(qū)分別進

6、行大體觀察、組織學切片觀察和圖像分析新生骨的面積值。結果顯示術后8周實驗組的骨缺損幾乎完全修復，在三組中效果最好?？瞻捉M術后8周缺損區(qū)僅僅充滿纖維和結締組織。在RWVB構建的生物衍生骨支架與成骨細胞的復合物具有很好的修復大段骨缺損的能力。總之，本研究確定了在RWVB和RWHMB中擴增骨組織工程種子細胞的最佳工藝和操作參數(shù)，明確了這兩種反應器都可以提供低剪切力的培養(yǎng)環(huán)境，而且細胞之間有三維聯(lián)系的機會，成骨細胞表現(xiàn)出良好的體外擴增能力，適于