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文檔簡(jiǎn)介
1、豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的豬的一種高度傳染病,又稱“豬藍(lán)耳病”,本病以妊娠母豬的繁殖障礙(后期流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱胎)及各種年齡豬特別是仔豬的呼吸道疾病(間質(zhì)性肺炎)為特征。本病給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,現(xiàn)已成為危害規(guī)?;B(yǎng)豬生產(chǎn)的主要疫病之一。目前,已有商品化的弱毒疫苗和滅活苗用于PRRS的防制,但由于其自身的缺陷而不能提供有效的免疫保護(hù).PRRSV屬于尼多病毒目動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬
2、成員,為有囊膜、單股正鏈RNA病毒,其致病機(jī)理和免疫特性尚不十分清楚。 本研究設(shè)計(jì)構(gòu)建了表達(dá)PRRSV膜相關(guān)蛋白GP3、GP4、GP5和M蛋白的重組腺病毒,通過小鼠免疫試驗(yàn)篩選了PRRSV重組腺病毒免疫候選分子,為PRRSV基因工程疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。 1.PRRSV CTL細(xì)胞免疫檢測(cè)方法的建立 為了探討PRRSV GP3、GP4、GP5、M蛋白基因誘導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的能力,建立一種非放射性、簡(jiǎn)
3、便易行的檢測(cè)特異性CTL的方法,應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增得到GP3、GP4、GP5和M蛋白基因并克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-GP3、pcDNA3-GP4、pcDNA3-GP5和pcDNA3-M。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NIH3T3細(xì)胞,G418篩選克隆,經(jīng)間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)目的蛋白表達(dá),成功培育了4株能分別表達(dá)PRRSV GP3、GP4、GP5、M蛋白的細(xì)胞株NIH3T3/GP3、NIH3T3/GP
4、4、NIH3T3/GP5和NIH3T3/M,可作為PRRSV CTL,檢測(cè)方法中的靶細(xì)胞。以NIH3T3細(xì)胞為靶細(xì)胞確定了最適靶細(xì)胞數(shù)(2×10<'5>/mL),建立了檢測(cè)PRRSV特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的殺傷效應(yīng)的乳酸脫氫酶釋放法。 2.PRRSV M與GP5蛋白融合表達(dá)及其免疫特性研究 為了提高GP5蛋白的免疫原性,在構(gòu)建了表達(dá)GP5蛋白重組腺病毒的基礎(chǔ)上,將PRRSV的M蛋白與GP5融合表達(dá),間接免疫熒光試驗(yàn)和We
5、stern blot證明,成功構(gòu)建了融合表達(dá)M與GP5蛋白的重組腺病毒(rAd-M-GP5)。取120只BALB/c小鼠,隨機(jī)分成5組,每組24只,將重組腺病毒rAd-GP5(表達(dá)GP5蛋白)、rAd-M(表達(dá)M蛋白)和rAd-M-GP5(表達(dá)M-GP5融合蛋白)免疫小鼠,間隔兩周加強(qiáng)免疫一次.對(duì)照組分別注射wtAd(野生型腺病毒)或PBS,觀察56天,間隔2周檢測(cè)PRRSV中和抗體,比較其細(xì)胞免疫水平,結(jié)果為:加強(qiáng)免疫后2周rAd-M
6、-GP5免疫組中和抗體滴度明顯高于rAd-GP5免疫組,抗體效價(jià)達(dá)到1:102(56dpi)。同時(shí),免疫rAd-M-GP5的小鼠產(chǎn)生了比tad-M(28%)更高水平的PRRSV特異的CTL反應(yīng),達(dá)到36.2%(42dpi),而rAd-GP5產(chǎn)生的PRRSV特異的應(yīng)答較低。該結(jié)果說明,M與GP5融合后能顯著增強(qiáng)GP5蛋白誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。 3.GP3蛋白的信號(hào)肽序列和N-端疏水域?qū)P3免疫特性的影響 次要
7、結(jié)構(gòu)蛋白GP3與免疫保護(hù)有關(guān),但是其免疫特性知之甚少。為了研究信號(hào)肽序列和N-端疏水域?qū)P3免疫特性的影響,構(gòu)建了表達(dá)缺失該區(qū)域(aa2~64)的GP3蛋白的重組腺病毒(rAd-tGP3),并將其免疫特性與GP3進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn),小鼠在加強(qiáng)免疫重組腺病毒rAd-tGP3和rAd-GP3后2周產(chǎn)生了PRRSV特異的細(xì)胞免疫應(yīng)答,包括T細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒T細(xì)胞應(yīng)答。而且,免疫rAd-tGP3的小鼠的應(yīng)答水平(中和抗體1:14、SI為4.5
8、、殺傷率為36%(56dpi))明顯高于rAd-GP3免疫組(中和抗體1:10、SI為3.3、殺傷率為28%(56dpi)).表明GP3蛋白的前64個(gè)氨基酸對(duì)GP3蛋白的構(gòu)象和抗原結(jié)構(gòu)可能有重要影響。 4.GP3和GP4蛋白對(duì)GP5蛋白的協(xié)同免疫特性研究 為了研究GP3或GP4蛋白能否協(xié)同GP5蛋白的免疫原性,分別將GP3、GP4、GP3和GP4與GP5蛋白融合表達(dá),間接免疫熒光試驗(yàn)和western blot證明,成功構(gòu)
9、建了融合表達(dá)GP3-GP5(rAd-GP3-GP5)、GP4-GP5(rAd-GP4-GP5)以及GP3-GP4-GP5(rAd-GP3-GP4-GP5)的重組腺病毒。同時(shí)還構(gòu)建了2株重組腺病毒,分別表達(dá)單個(gè)的GP3和GP4蛋白。將重組腺病毒免疫BALB/c小鼠,間隔兩周加強(qiáng)免疫一次。對(duì)照組分別注射wtAd或PBS。結(jié)果發(fā)現(xiàn),小鼠在加強(qiáng)免疫后2周產(chǎn)生了PRRSV特異的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。然而,只有免疫rAd-GP3-GP5、rAd-GP
10、4-GP5、rAd-GP3-GP4-GP5的小鼠產(chǎn)生了高滴度的中和抗體,效價(jià)分別達(dá)到1:82、1:96、1:120(56dpi),并誘導(dǎo)較強(qiáng)的淋巴細(xì)胞增殖。同時(shí),相對(duì)于rAd-GP3(21.4%)和rAd-GP5(18%)免疫組,免疫rAd-GP3-GP5和rAd-GP3-GP4-GP5的小鼠產(chǎn)生了更高水平的PRRSV特異的CTL反應(yīng),殺傷效率分別為37.5%和44.7%(42dpi)。說明GP3蛋白或GP3與GP4蛋白對(duì)GP5蛋白的體
11、液免疫和細(xì)胞免疫有協(xié)同促進(jìn)作用。 5.GP5蛋白信號(hào)肽和非中和表位對(duì)其誘導(dǎo)中和抗體應(yīng)答的影響 為了研究GP5蛋白的信號(hào)肽和非中和表位對(duì)其誘導(dǎo)中和抗體的影響,構(gòu)建了表達(dá)缺失非中和表位(A)和/或信號(hào)肽序列的GP5蛋白的3個(gè)重組腺病毒,利用BALB/c小鼠評(píng)估它們誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的特性。即:表達(dá)缺失非中和表位(aa27-31)的GP5(rAd-GP5△27/31)、表達(dá)缺失A表位及A表位與中和表位(B)中間的序列(aa27-
12、36)的GP5(rAd-GP5△27/36)、以及表達(dá)缺失B表位之前的序列(包括信號(hào)肽,aa2-36)的突變體(rAd-GP5△2/36)。結(jié)果為:3株重組體接種小鼠后均產(chǎn)生了明顯的抗PRRSV抗體的應(yīng)答和明顯的中和抗體,其滴度達(dá)到1:30、1:19、1:14(56dpi),明顯高于表達(dá)野生型GP5的重組腺病毒rAd-GP5誘導(dǎo)的中和抗體(1:8).表明去除GP5蛋白A表位能提高其誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體,而且,信號(hào)肽序列及A表位周圍的序列能影
13、響中和抗體的產(chǎn)生水平。 6.GP5蛋白N-糖基對(duì)其誘導(dǎo)中和抗體應(yīng)答的影響 對(duì)于一些病毒來說,如HIV、SIV和HBV,“糖基屏蔽效應(yīng)”可能是病毒逃避中和免疫應(yīng)答的一個(gè)主要機(jī)理,使得病毒在體內(nèi)持續(xù)感染。PRRSV GP5蛋白含有4個(gè)糖基化位點(diǎn),分別位于N30、N33、N44、N51。為了研究各位點(diǎn)的糖基對(duì)GP5蛋白免疫特性的影響,本研究共構(gòu)建了6個(gè)重組腺病毒,分別為表達(dá)野生型的GP5以及突變1-4個(gè)糖基化位點(diǎn)的突變體: r
14、Ad-GP5(wtGP5)、 rAd-GP5N44S(N44S)、rAd-GP5N44/51S(N44/51S) 、 rAd-GP5N30/N44/51S(N30/44/51S) 、rAd-GP5N30/N33/N44/51S(N30/33/44/51S)和rAd-GP5N30/N33S(N30/33S)。小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果為:5株表達(dá)GP5糖基化位點(diǎn)突變的重組體均可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的抗PRRSVELISA抗體,中和抗體水平明顯高于野生型
15、GP5重組腺病毒,說明,4個(gè)糖基化位點(diǎn)都能影響到GP5蛋白誘導(dǎo)中和抗體的能力。而且,rAd-GP5N30/N33s誘導(dǎo)的中和抗體滴度高于rAd-GP5N44S、 rAd-GP5N44/51S、 rAd-GP5N30/N44/51S,而低于rAd-GP5N30/N33/N44/51S,由于N30和N33殘基上的糖基靠近GP5蛋白的非中和表位(aa27~30),說明N30和N33這2個(gè)位點(diǎn)對(duì)誘導(dǎo)中和抗體非常重要.此外,野生型GP5和糖基化位
16、點(diǎn)突變體誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答沒有明顯的差異,說明,4個(gè)糖基化位點(diǎn)對(duì)GP5蛋白細(xì)胞免疫特性無明顯影響。 綜上所述,PRRSV M與GP5、GP3與GP5、GP3和GP4與GP5蛋白融合表達(dá)后,能明顯提高其誘導(dǎo)的中和抗體水平和細(xì)胞免疫應(yīng)答;GP5蛋白的糖基化位點(diǎn)和非中和表位能明顯影響其誘導(dǎo)中和抗體的能力;GP3蛋白具有較強(qiáng)的細(xì)胞免疫特性,從而為PRRSV重組腺病毒疫苗免疫候選分子設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù),為研究安全有效的PRRSV新型疫
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